高效液相色譜- 氫化物發生原子熒光光譜法測定食品中多形態硒含量

房 艷，王 貝，高俊海，張雅莉

(1.譜尼測試集團股份有限公司， 北京 100095;2.譜尼測試集團北京科學技術研究院有限公司， 北京 100095)

硒是一種人體必需的微量元素，因其具有清除細胞雜質、抗氧化、參與谷胱甘肽過氧化酶合成等特性而具有抗衰老、抗干細胞壞死、提高免疫力和抗癌變等功效，被譽為“抗癌之王”、“生命的火種”和“長壽元素”[1]。但是，硒元素的生物利用度、有效性、毒性以及代謝規律不僅與其總量有關，更是與其存在形態密切相關[2-3]。硒形態一般分為單質硒、無機硒和有機硒。其中，單質硒幾乎無法被人體吸收；來源于金屬礦藏副產品的亞硒酸鹽和硒酸鹽是無機硒常見的兩種形式，無法被生物有效的吸收和利用，因而被嚴格地限制用量[4]。而有機硒通常經生物轉化而來，有利于人體吸收利用，具有較強的生物活性且安全無副作用[5]，典型的有機硒包括硒代氨基酸(硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸)、硒蛋白、甲基硒化物、硒核酸和硒多糖等。因此，單以硒總含量無法準確評價產品質量，且存在一定的安全隱患[6]，準確的定性定量不同形態的硒元素顯得十分重要。尤其對供給特殊人群的特膳食品的質量監管和保障消費者健康安全具有重要意義。

目前，對富硒食品中硒元素的研究大多集中在總量測定[7-9]，對其不同形態的檢測技術研究還相對較少。早期的硒形態分析，多通過預處理過程實現硒形態的初步分離，通過測定不同樣液中硒元素的總量并結合差量法計算出有機硒、無機硒或部分硒形態的含量[6，10-13]。近年來隨著儀器聯用技術的快速發展，食品中硒形態的分析方法包括毛細管電泳色譜- 電感耦合等離子體質譜法(capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry，CE-ICP-MS)[14]、高效液相色譜- 氫化物發生原子熒光光譜法(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry，HPLC-HG-AFS)[15]、高效液相色譜- 電感耦合等離子體質譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)[16-17]等成為了研究熱點。其中，HPLC-HG-AFS具有儀器普及率高、分析成本低等特點，且靈敏度與電感耦合等離子體質譜相當[2]，目前已廣泛應用于砷、汞、硒等元素的分析。然而，食品等樣品由于基質較為復雜，干擾因素較多，且干擾物質難以去除，因此很難準確測定其中多形態硒含量。

本研究擬通過優化條件參數，建立一種HPLC-HG-AFS測定食品中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的分離檢測技術，并以富硒酵母作為樣品基質進行方法驗證。另外，用本方法對4種市售富硒食品(富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母)中的4種硒形態進行了檢測，為相關富硒食品的硒形態評價和質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硒酸根[Se(VI)]、硒代蛋氨酸(SeMet)，分析純，中國計量科學研究院；硒代胱氨酸(SeCys2)，分析純，國家標準物質中心；甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)，分析純，美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶，來源于牛胰腺，活力值1.0×104U/mg，國家標準物質中心；蛋白酶XIV，來源于灰色鏈霉菌，活力值 3.5 U/mg，美國Sigma-Aldrich公司；甲醇，色譜純，美國Thermofisher公司；磷酸氫二銨，分析純，天津市華東試劑廠；硼氫化鉀，分析純，天津福晨化學試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，北京化工廠；鹽酸，優級純，天津市津科精細化工研究所；三羥甲基氨基甲烷，分析純，天津市華東試劑廠；三氟乙酸，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸，分析純，西隴科學股份有限公司；碘化鉀，分析純，西隴科學股份有限公司。

富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母均為市售。

1.2 儀器與設備

LC- 3000型原子熒光形態分析儀，北京海光儀器有限公司；Coolinics CTR- 240型恒溫水浴鍋，日本Hitachi公司；Vortex- Genie 2型渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；Millipore- Q型超純水凈化儀，美國Millipore-Q公司；SB25- 12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Velocity 18R型離心機，澳大利亞Dynamica公司。

1.3 標準曲線的建立

分別準確稱取適量硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸，用水溶解并定容，配制成100 mg/L的標準儲備液，4 ℃儲存；使用時，用水稀釋并定容，配制成系列濃度的混合標準工作液，繪制標準曲線。

1.4 樣品預處理

將樣品粉碎研磨，混勻；準確稱取1.0 g試樣于250 mL容量瓶中，加入200 mL Tris緩沖液(0.1 mol/L，pH=10)，漩渦混勻，超聲提取30 min；加入0.2 g蛋白酶和0.2 g胰蛋白酶，旋渦混勻，60 ℃水浴下酶解4 h，酶解過程中將容量瓶取出渦旋混勻數次；酶解后水定容，取20 mL酶解液于塑料離心管中，4 000 r/min離心10 min；取1.0 mL上清液，過0.22 μm濾膜，供HPLC-HG-AFS分析，外標法定量。

1.5 儀器分析

1.5.1高效液相色譜分析條件

Hamilton PRP-X100 (250 mm×4.1 mm×10 μm)色譜柱；流動相為V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2，洗脫15 min；進樣量為100 μL；柱溫為室溫。

1.5.2氫化物發生原子熒光光譜分析條件

氫化物發生器條件。還原劑為20 mmol/L 硼氫化鉀水溶液，含w=0.5%氫氧化鉀和w=0.1%碘化鉀，流速為4.0 mL/min；載液為φ=7%鹽酸水溶液，流速為6.0 mL/min。

原子熒光檢測器條件。原子化器溫度為200 ℃；負高壓為320 V；燈電流為100 mA；原子化器高度為8 mm；載氣和屏蔽氣為氬氣；載氣流速為500 mL/min；屏蔽氣流速為700 mL/min。

2 結果與討論

2.1 方法檢出限分析

將4種硒形態混合標準工作液注入高效液相色譜- 氫化物發生原子熒光光譜，采集譜圖見圖1，相應的譜圖信息和各硒形態的檢出限見表1。由圖1可知，硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在設定條件下峰形對稱且充分分離。由表1可知，4種物質均在5～100 ng/mL的濃度范圍內線性良好(R2>0.999)，且以3倍信噪比計，硒酸根與甲基硒代半胱氨酸的方法檢出限為25 μg/kg，硒代胱氨酸與硒代蛋氨酸的方法檢出限為50 μg/kg。

圖1 4種硒形態標準品混合物的色譜Fig.1 Chromatogram of mixed standards of 4 selenium speciations

表1 4種硒形態標準品混合物的方法檢出限

2.2 預處理方法的優化

常見的預處理方法包括酸解法、緩沖鹽提取法和酶解法等[18-19]。本研究需選擇一種適用于有機硒和無機硒同時提取的預處理方式。其中，酸解法和緩沖鹽提取法對無機硒的提取效果較好，但無法有效提取有機硒，且強酸的強還原能力易導致硒形態發生轉變。酶解法的特異性較強，能夠將硒代氨基酸從多肽鏈中分解下來，且反應條件溫和，不易發生形態之間的轉化[5，18]。因此，本研究以酶解法進行預處理，并對酶解溫度進行考察。使用富硒大米在40、50、60、70 ℃分別酶解4 h，4種目標物的提取效率見圖2，提取效率為各目標物的檢測值(扣除本底)與加標量的百分比。結合4種硒形態化合物的提取效率，選用60 ℃為酶解溫度。

圖2 溫度對提取率的影響Fig.2 Effect of different temperature on extraction efficiency

2.3 高效液相色譜條件的優化

4種物質的充分分離對于物質的定性定量是最為關鍵的。相關資料表明，反相C18柱適用于有機硒的分離，但對強極性的無機硒幾乎無保留。因此選定兼具反相保留和離子交換能力的陰離子交換色譜柱用于無機硒和有機硒的同時分離檢測。

圖3 三氟乙酸- 磷酸氫二銨水溶液為流動相的 混合標準溶液高效液相色譜Fig.3 Mixed standard HPLC spectrum of trifluoroacetic acid-diammonium hydrogen phosphate as mobile phase

以20 mmol/L磷酸氫二銨水溶液為流動相時，硒酸根、硒代胱氨酸與甲基硒代半胱氨酸的譜峰部分重疊且峰型較差。流動相條件的不同對于多物質的峰型、分離度等具有顯著影響，包括pH值、有機相比例等。結合相關資料并優化pH，流動相pH為6.0時，4種硒化物的峰形明顯改善，峰寬較窄且對稱性好。以三氟乙酸- 磷酸氫二銨水溶液(pH=6.0)與甲酸- 磷酸氫二銨水溶液(pH=6.0)為流動相分別測試時，兩種流動相的分離效果相似，但硒酸根、硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸的峰仍未完全分離，見圖3。在流動相中加入一定比例甲醇，以V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液為流動相時，4種硒形態化合物在15 min內基本實現基線分離(圖1)。因此，選擇V(20 mmol/L磷酸氫二胺水溶液，pH=6.0)∶V(甲醇)=98∶2的混合溶液為流動相。

2.4 氫化物發生原子熒光光譜條件的優化

在氫化物發生原子熒光光譜中，硼氫化鉀既可以與硒反應生成氣態的硒化氫，又可以與鹽酸反應為原子熒光提供適量的氫氣。本研究考察了10、20、30、40 mmol/L的硼氫化鉀水溶液對硒元素分析的影響如圖4。綜合4種硒形態化合物的最優峰面積，選用20 mmol/L硼氫化鉀水溶液為還原劑。

2.5 方法學驗證

使用優化后的方法預先測得富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸的含量分別為1.90、3.08、13.53 mg/kg，甲基硒代半胱氨酸未檢出。以此樣品為基質進行標準物質加入實驗，加標量分別為硒酸根1.63 μg和2.13 μg，硒代胱氨酸2.63 μg和3.50 μg，甲基硒代半胱氨酸0.3 μg和0.5 μg，硒代蛋氨酸11.5 μg和15.5 μg。樣品加標回收率和RSD值，見表2。

表2 富硒酵母加標回收率Tab.2 Standard recovery rate of selenium-rich yeast

結果顯示，樣品在兩個濃度梯度的平均回收率在81.37%～93.80%，RSD為2.80%～7.22%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的要求。說明該方法具有較高的準確度和精密度。

2.6 4種市售食品樣品的分析檢測

本研究對市售的富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母樣品進行了分析，分析結果見圖5和表3。其中，甲基硒代半胱氨酸在4種樣品中均未檢出；硒酸根在4種樣品均檢出且富硒大米中僅檢出硒酸根；富硒香菇和富硒酵母相比而言含有的硒元素形態更多。以上說明，此次研究使用的富硒大米不適合人體用來補充硒元素，而此次研究使用的富硒酵母和富硒香菇則可作為人體補充硒元素的良好來源。

圖5 4種市售富硒食品的色譜Fig.5 Chromatograms of 4 commercially available Se-enriched foods

3 結 論

本研究建立了一種食品中多形態硒的高效液相色譜- 氫化物發生原子熒光光譜法，適用于富硒蛋白粉、富硒大米、富硒香菇和富硒酵母中硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的檢測。本方法具有靈敏度高、適應性廣、設備便宜、價格低廉等優點，解決了食品基質較為復雜而產生的干擾問題，4種硒形態化合物在5～100 μg/kg線性良好(R2>0.999)，方法檢出限可達到25～50 μg/kg，且具有較高的準確性和精密度，為食品中相關產品的硒形態評價和質量控制提供了方法和依據。

表3 實驗樣品硒含量Tab.3 Selenium content of experimental samples mg/kg