Cyclobacterium qasimii脫乙酰酶的異源表達及酶學性質

馬佳菲，秦 臻，范立強，趙黎明,*，蔣麗華，*

(1.華東理工大學 生物工程學院/發酵工業分離提取技術研發中心/生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237； 2.上海大學 生命科學學院， 上海 201900)

氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)是天然的氨基單糖，在自然界中廣泛存在，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)是甲殼素(又稱為幾丁質)的結構單元。GlcN是唯一的堿性單糖，游離的氨基使其具有生物活性。GlcN不僅可用于治療關節炎，促進關節生理活性的正常運行[1-4],而且具有多種生物活性，如抗癌[5-7]、抗氧化[8-11]、抑菌[12-13]、抗病毒[14]等。GlcN已被廣泛應用到醫藥、飼料、保健食品、化妝品等領域中。

GlcN的廣泛使用促使其需求量不斷增加，刺激了其工業化生產的發展。目前GlcN的生產方法有酸水解法、微生物發酵法和生物催化法。傳統的甲殼素酸水解法[15-17]需在高溫條件下，并在濃酸中進行水解，存在環境污染嚴重、設備要求高等問題。通過微生物發酵法制備GlcNAc[18-19],并進一步脫乙?；@得GlcN，已逐漸成為規?；镏圃霨lcN的主要途徑；然而該方法的脫乙酰反應仍需要采用酸水解來實現。Deng等[20-21]還報道了微生物發酵法直接生產GlcN，但在發酵過程中，GlcN降解速度快，且GlcN及其降解產物對宿主細胞具有抑制作用，導致產量較低。Jiang等[22-23]報道了以GlcNAc為底物，全細胞催化生產GlcN，此方法環境污染少，但仍未達到工業化生產的需求。基于已有的生產方法，利用微生物發酵法得到的GlcNAc，再利用一種環境友好、成本低、生產效率高且工藝簡單的生物酶催化法將GlcNAc脫乙?；aGlcN，將是一種更理想的GlcN生產方法。

已報道的可應用于GlcN生產的脫乙酰酶存在反應溫度高、底物親和力差等問題；因此，挖掘穩定性好、反應條件溫和、底物親和力高的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶具有重要的意義。來源于Cyclobacteriummarinum的脫乙酰酶CmCBDA是第一個報道的能夠在體外溫和條件下催化GlcNAc脫乙?；蒅lcN的酶，且能耐受較高的底物濃度[24]。本研究擬利用生物信息學手段篩選與CmCBDA氨基酸序列相似性最高的卡西氏菌Cyclobacteriumqasimii來源脫乙酰酶(CqCBDA)，對CqCBDA的編碼基因進行克隆、表達及純化，并進行酶學性質表征，以期為工業化生產GlcN提供具有應用價值的生物酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cyclobacteriumqasimii脫乙酰酶基因CqCBDA由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；大腸桿菌(E.coli)DH5α和BL21(DE3)感變態細胞，購自上?？禐樵噭┥锟萍脊?；帶有卡那霉素抗性基因的載體pET28a(+)，購自美國Novagen有限公司；Taq DNA聚合酶，購自南京Vazyme生物科技有限公司；T4 DNA連接酶和限制性內切酶，購自美國New England Biolabs有限公司；DNA Marker DL2000和蛋白 Marker，購自大連TaKaRa生物工程有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；N-乙酰氨基葡萄糖，購自上海麥克林生化科技有限公司。

LB液體培養基：5 g酵母提取物，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，用去離子水定容至1 L。LB固體培養基：5 g酵母提取物，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl，20 g瓊脂粉，用去離子水定容至1 L。

1.2 儀器與設備

MyCycler聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀、Power Pac Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；JY92- IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV765型紫外- 可見分光光度計，上海佑科儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1基因序列篩選與分析

根據NCBI數據庫提供的已報道的具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的Cyclobacteriummarinum來源脫乙酰酶基因CmCBDA的編碼序列(GenBank登錄號：WP_149392827)，利用BlastP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析其與其他蛋白的序列相似性，篩選得到Cyclobacteriumqasimii來源的具有潛在N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的CqCBDA基因序列(GenBank登錄號：WP_020891027)。使用DNAMAN軟件分析CqCBDA核酸序列并確定酶切位點，并使用Primer Premier 5軟件設計引物。根據數據庫中脫乙酰酶氨基酸序列，使用MEGA 7.0軟件按照 Neighbor- joining運算方法構建系統發育樹[25]，使用ClustalX2軟件進行多重序列比對。

1.3.2重組質粒的構建

1.3.3重組CqCBDA的表達與純化

將含有重組質粒pET- 28a- CqCBDA的陽性工程菌接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下培養至OD600達到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷，30 ℃誘導培養12 h。離心收集菌體，用緩沖液A(20 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)重懸，超聲破碎后10 000 r/min離心10 min，得到的上清液即為含有可溶性重組蛋白的粗酶液。將粗酶液上樣至預先平衡好的Ni-IDA柱后，先用緩沖液A和緩沖液B(40 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)洗滌，再用緩沖液C(200 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH值8.0)沖洗，收集帶有組氨酸標簽(Histidine tag，His-tag)的重組CqCBDA。SDS- PAGE法檢測重組蛋白表達純化效果。

1.3.4酶學性質表征

1.3.4.1 蛋白定量和酶活力的檢測

1)蛋白定量檢測[26]。以牛血清蛋白作為標準品繪制標準曲線，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。在1 mL的考馬斯亮藍試劑中，加入100 μL適當稀釋的酶液，迅速混勻，室溫反應3 min后，以加入等量蒸餾水的試劑作為空白對照。使用分光光度計檢測樣品在595 nm波長下的吸光值，根據測得的吸光值和標準曲線計算出純酶中的蛋白濃度。

薄層層析色譜法(thin-layer chromatography，TLC)定性檢測得到的可溶性重組酶是否具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性。TLC條件：展開劑為異丙醇、水和氨水混合液(三者體積比為15.0∶1.0∶7.5)；顯色劑的配制方法為，將適量的大茴香醛溶于乙醇中，緩緩加入少量的濃H2SO4，再加入少量的醋酸混合，展開時間為60 min。

2)酶活力檢測。將270 μL用緩沖液配制而成的10 g/L GlcNAc溶液在水浴鍋中預熱2 min，然后加入30 μL適當稀釋的酶液，反應10 min，立即沸水浴加熱5 min終止反應。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測反應液中GlcN的濃度，計算酶活力。

酶活力單位(U)定義：在酶促反應條件下，每分鐘生成1 μmoL GlcN(N-乙酰氨基葡萄糖)所需的脫乙酰酶酶量。

HPLC條件[27]：色譜柱為氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器為紫外檢測器，檢測波長為195 nm；流動相為體積分數為35%的水相(稱取3.5 g K2HPO4，加水溶解，加入0.25 mL氨水，混勻，用磷酸調節pH值至7.5，用水定容至1 L)和65%的乙腈，流速為1 mL/min；色譜柱溫度為35 ℃；進樣量為10 μL。

1.3.4.2 最適溫度和熱穩定性的測定

重組CqCBDA在不同溫度(25～60 ℃)下分別進行反應，測定其酶活力。以測得的最高酶活力為100%，計算不同溫度下的相對酶活力，確定該酶的最適溫度。

以未經處理的酶液的酶活力為100%，將重組CqCBDA分別置于不同溫度(30～80 ℃)下孵育60 min后，在最適溫度下測定殘余酶活力，確定該酶的熱穩定性。

1.3.4.3 最適pH值和酸堿穩定性的測定

重組CqCBDA在不同pH值(pH值為6.0～10.0)的緩沖液中，在最適溫度下分別進行反應，測定其酶活力。以測得的最高酶活力為100%，計算不同pH值條件下的相對酶活力，確定該酶的最適pH值。

以未經處理的酶液的酶活力為100%，將重組CqCBDA分別置于不同pH值(pH值為6.0～10.0)的緩沖液中，在最適溫度條件下孵育60 min后，在最佳反應條件下測定殘余酶活力，確定該酶的酸堿穩定性。

1.3.4.4 動力學參數的測定

為了測定重組CqCBDA的動力學參數，將其分別置于不同質量濃度(0.25～64.00 mg/mL)的GlcNAc溶液中，在最適反應條件下進行反應，測定其酶活力。通過Sigma plot軟件計算Vmax和Km值，從而計算出Kcat值和Kcat/Km值。

1.3.4.5 金屬離子和EDTA對酶活力影響的測定

在反應液中分別加入終濃度為10 mmol/L的不同金屬離子(Ni2+、Mn2+、Ca2+、K+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Cu2+、Zn2+)和EDTA，以不加金屬離子的酶液的酶活力為100%，測定金屬離子和EDTA對重組CqCBDA酶活力的影響。

1.4 數據處理與分析

采用軟件MEGA7.0和Clustacx2進行氨基酸序列分析，采用軟件Origin 9.0對實驗數據進行統計分析和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 CqCBDA的序列分析結果

為了篩選得到具有N-氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的脫乙酰酶，利用Blast比對CmCBDA與其他蛋白的序列相似性，得到Cyclobacteriumqasimii來源的脫乙酰酶基因(CqCBDA)，基因全長879 bp，編碼292個氨基酸。Blast分析結果顯示：CqCBDA氨基酸序列與CmCBDA序列相似度最高，達78.40%。圖1為CqCBDA的序列分析結果，圖1(a)的CqCBDA氨基酸序列系統發育樹同樣顯示：CqCBDA與CmCBDA具有最近的進化關系。

CqCBDA多重序列比對包括：海環桿菌(WP_149392827)、幽門螺桿菌(WP_111636464.1)以及鼠尾菌(WP_108424554.1、WP_119608117.1)來源的脫乙酰酶。圖上方的數字表示氨基酸的殘基序號；保守的氨基酸標以紅色陰影，活性中心的兩個催化氨基酸殘基(His230和Arg253)以星號標注。圖1 CqCBDA的序列分析結果Fig.1 Results of sequence analysis of CqCBDA

圖1(b)為CqCBDA與Ydjc家族其他來源的脫乙酰酶多重序列比對結果。圖1(b)顯示：有多處高度保守的氨基酸序列重合[28]，如與產物乙酸分子的氧原子形成氫鍵的Arg253，與乙酸分子的另一個氧原子形成氫鍵的His230，尤其是與Ydjc家族脫乙酰酶氨基酸序列中高度保守的Asp22、His72和His143氨基酸殘基也完全一致；因而，推斷CqCBDA可能歸屬于Ydjc家族。

2.2 重組質粒的構建結果

以含目的基因的菌體作為模板，進行PCR擴增，PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2。圖2顯示：PCR擴增得到一條900 bp左右的特異性條帶，其大小符合理論預期，與CqCBDA基因大小一致。經雙酶切的基因和表達載體連接后，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，經測序鑒定，成功構建并得到重組表達質粒pET- 28a- CqCBDA。

M：DNA Marker；1：PCR擴增產物。圖2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gelelectrophoresis result of gene fragment

2.3 重組蛋白的表達與純化結果

表達質粒pET- 28a- CqCBDA轉化至E.coliBL21感受態細胞后，在LB液體培養基中進行培養，并用IPTG誘導表達，采用Ni- IDA親和層析柱對上清液中的可溶性目的蛋白進行純化。通過SDS- PAGE分析蛋白表達情況和純度，蛋白凝膠電泳結果如圖3。圖3顯示：全細胞液和上清液中均含有33 kDa大小的條帶，與目的蛋白分子質量大小相同，表明已成功表達了可溶性重組目的蛋白；可溶性蛋白的含量較高，且成功獲得高純度的可溶性目的蛋白。

M：蛋白marker；1：全細胞液；2：超聲破碎上清液；3：超聲破碎沉淀；4：純化的目的蛋白。圖3 重組CqCBDA的表達和純化結果Fig.3 Results of expression and purification of recombinant CqCBDA

2.4 酶學性質分析

2.4.1重組CqCBDA的催化活性

以適當濃度的GlcNAc溶液作為反應底物，檢測重組CqCBDA的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性，TLC檢測結果如圖4。圖4顯示：隨著反應時間的延長，GlcN的顏色加深，GlcNAc的顏色變淺，說明GlcNAc不斷脫乙酰基生成GlcN，這表明重組CqCBDA具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性。

圖4 重組CqCBDA的N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰 酶活性的TLC檢測結果Fig.4 TLC analysis of recombinant CqCBDA N-acetylglucosamine deacetylase activity

GlcNAc和GlcN的高效液相色譜圖如圖5。圖5顯示：GlcNAc和GlcN的出峰時間分別為4.925 min和8.259 min，兩者的出峰時間差距較大，說明GlcNAc和GlcN能很好地分離。以GlcNAc為底物，重組CqCBDA的比酶活力為11.5 U/mg。

圖5 GlcNAc和GlcN的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of GlcNAc and GlcN

2.4.2溫度對重組CqCBDA酶活力的影響

在不同溫度下測定酶活力，重組CqCBDA的最適溫度測定結果如圖6。圖6顯示：CqCBDA的最適反應溫度為40 ℃，在該反應溫度下酶活力達到最大值。當溫度低于30 ℃或高于45 ℃時，CqCBDA的相對酶活力降低至50%以下；當溫度高于50 ℃時，酶活力大幅度降低，相對酶活力降至10%以下。GlcN不穩定，會發生褐變，尤其是在較高溫度下會加速褐變和副反應的發生，且溫度越高褐變越明顯[29]。已報道的、可應用于GlcN生產的脫乙酰酶屬于高溫酶[22],在溫度較高條件下進行反應，GlcN褐變損失增加。CqCBDA能在溫和條件下催化GlcNAc脫乙?；aGlcN，減少褐變損失。

將酶液在30～80 ℃條件下孵育60 min，測定其殘余酶活力。重組CqCBDA的熱穩定性的測定結果如圖6(b)。圖6(b)顯示：當孵育溫度低于40 ℃時，CqCBDA具有高穩定性，其殘余酶活力仍能保持在90%以上；當孵育溫度高于40 ℃時，穩定性出現大幅度下降，這說明CqCBDA不耐高溫。

2.4.3pH值對重組CqCBDA酶活力的影響

在不同pH值條件下測定酶活力，重組CqCBDA的最適pH值測定結果如圖7。圖7(a)顯示：CqCBDA的最適反應pH值為7.6，在該pH值條件下酶活力達到最大值；當pH值在6.8～7.6時，CqCBDA的活性較高，其相對酶活力均在80%以上；當pH值小于6.4或大于8.0時，CqCBDA的相對酶活力降低至60%以下。GlcN的褐變與pH值密切相關，美拉德反應發生在pH值為4～9，隨著pH值上升，褐變加劇[25]。CmCBDA的最適pH值為9.0[24]，相比于CmCBDA，在CqCBDA的最適反應pH值條件下，GlcN的非酶褐變減緩。

將酶液稀釋于不同pH值的緩沖液中，在40 ℃條件下孵育60 min，測定其殘余酶活力。重組CqCBDA的酸堿穩定性測定結果如圖7(b)，圖7(b)顯示：在較廣的pH值范圍內(pH值為6.0～10.0)，CqCBDA能保持良好的酸堿穩定性，殘余酶活力均維持在70%以上；尤其是當pH值在7.5～8.5時，其殘余酶活力仍能維持在90%以上，說明CqCBDA在弱堿性條件下穩定性高。

圖6 溫度對重組CqCBDA酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on purified recombinant CqCBDA

圖7 pH值對重組CqCBDA酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on purified recombinant CqCBDA

2.4.4動力學參數測定結果

在40 ℃、pH值為7.6的最適反應條件下，以不同濃度的GlcNAc溶液作為底物，分別測定重組CqCBDA的比酶活力，通過Sigma plot軟件計算其動力學常數，動力學擬合曲線如圖8。CqCBDA的Vmax和Km分別為11.69 U·mg-1和3.90 mmol·L-1，計算可得Kcat和Kcat/Km分別為6.43 s-1和1.64 (s·mmol·L-1)-1。CmCBDA的Km值為(48±18)mmol·L-1[25]，相比于CmCBDA，CqCBDA與底物GlcNAc的親和力更高，更有利于酶催化反應的進行。

圖8 重組CqCBDA的酶促反應動力學方程擬合曲線Fig.8 Enzymatic reaction kinetic equation fitting curve of recombinant CqCBDA

2.4.5金屬離子對重組CqCBDA酶活力的影響

金屬離子通常作為輔因子參與到生物催化反應過程，或者參與到酶高級結構的穩定化中，因而金屬離子對酶活力影響的考察對于指導生物催化劑的制備和穩定化具有重要的意義。不同的金屬離子對于重組CqCBDA酶活力的影響，實驗結果如表1。表1顯示：Co2+、Cu2+、Zn2+對酶活力有顯著的抑制作用，其他金屬離子影響較小，EDTA對CqCBDA的酶活力影響也不大。結果表明：CqCBDA不是金屬依賴型酶，也不嚴格依賴某種金屬離子。

表1 金屬離子和EDTA對重組CqCBDA酶活力的影響Tab.1 Effects of metal ions and EDTA on activity ofrecombinant CqCBDA

3 結 論

GlcN具有多種生理活性，N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶作為酶法綠色制備GlcN中具有重要意義的水解酶，受到廣泛關注。本研究篩選得到了具有N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶活性的卡西氏菌Cyclobacteriumqasimii來源的脫乙酰酶(CqCBDA)，并通過構建系統進化樹和序列相似性比對分析，推斷其應歸屬于Ydjc家族。利用基因工程的手段將CqCBDA在E.coliBL21(DE3)中進行異源表達，成功得到可溶性重組CqCBDA。酶學性質研究表明：CqCBDA的最適反應溫度為40 ℃，最適pH值為7.6，能在溫和條件下選擇性催化GlcNAc生產GlcN，可減少反應過程中GlcN因褐變而導致的損失；在溫度低于40 ℃的條件下，CqCBDA能保持90%以上的相對酶活力，具有良好的穩定性，金屬離子對其酶活性的影響較小。CqCBDA具有酶法生產制備GlcN的應用潛力，希望能為GlcN的酶法制備提供理論依據。