駿棗的多糖提取及其蛋白脫除研究

曹澤虹，董玉瑋，李 超,張廣亮

(徐州工程學院 食品(生物)工程學院/江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室/江蘇省食品與生物工程實驗中心， 江蘇 徐州 221008)

和田駿棗(ZiziphusjujubaMill. cv Junzao)又叫和田玉棗，是中國新疆地理標志產品，也是無公害綠色產品[1]。由于和田地處新疆南部，干旱少雨，光照時間長，晝夜溫差大，因此和田駿棗的質量明顯高于其他棗類，富含多糖、維生素、微量元素及黃酮類等生物活性物質。許多實驗結果表明，紅棗多糖具有提高免疫力和抗氧化的生理功能，可以補氣養血、預防心血管疾病，還有抗補體活性、抗腫瘤活性和促進淋巴細胞增殖的作用[2-4]。

采用水溶提取法提取紅棗多糖[5]，具有無需大型設備、操作簡單安全性好、成本低、提取率高等優勢，適合工業化大規模生產[6]。由于提取工藝的限制，在紅棗多糖中往往會摻有一些蛋白質，影響其品質[7-8]，對紅棗多糖中蛋白質進行脫除，可以提高紅棗多糖的純度和品質。

本研究以和田駿棗為研究材料，探究利用水提法提取紅棗多糖的工藝流程，以及紅棗多糖的蛋白脫除方法，以期為紅棗多糖的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

和田駿棗(ZiziphusJujubaMill. cv Junzao)，購買于徐州市大潤發超市。

G- 250蛋白試劑，中國惠興生化試劑有限公司；考馬斯亮藍，天津市益力化學試劑有限公司；實驗用水為蒸餾水；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

7230G型可見分光光度計、FA2104N型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；PC- 1000型數顯式電熱恒溫水浴鍋、GZX- DH- 600型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠；L550型低速離心機，常州國華電器有限公司；FAD- 100A型組織粉碎機，華東冶礦機械廠；BCD- 13OH TB型海爾冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 紅棗的預處理

研究所用紅棗的預處理方法見圖1。

圖1 紅棗的預處理流程

1.4 多糖的提取實驗

1.4.1單因素實驗設計

取5份紅棗粉，每份1 g，以料液比、提取時間、提取溫度3個因素進行單因素設計實驗[9-12]。選取提取時間2 h、提取溫度60 ℃的條件下進行料液比實驗研究，料液比(m(紅棗粉)∶V(水))選取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL；選取提取溫度60 ℃、料液比1∶25 g/mL的條件下進行提取時間實驗研究，提取時間選取2、3、4、5、6 h；選取提取時間2 h、料液比1∶25 g/mL的條件下進行提取溫度實驗研究，提取溫度選取 60、70、80、90、100 ℃，研究各因素對紅棗多糖提取率的影響。

1.4.2響應面試驗設計

在單因素實驗基礎上，采取Box- Behnken設計方法，對料液比、提取時間和提取溫度進行響應面試驗，以提取率為響應值，通過實驗得到數據并對其進行分析，利用響應面法來優化提取工藝條件，由此可得到影響因素與響應值之間的擬合方程，生成響應面圖[13-14]，并利用軟件預測較佳工藝條件。

1.4.3多糖的提取

取稱1 g紅棗粉，按照較佳提取工藝進行提取，提取后離心，得到上清液，用旋轉蒸發儀進行減壓蒸發濃縮，在60 ℃的條件下蒸發20 min，得到濃縮液，緩慢加入4倍體積的體積分數為90%的乙醇溶液，放入4 ℃冰箱中冷藏12 h。將醇沉過夜的樣品在5 000 r/min條件下離心25 min，離心后將上清液倒出，取出沉淀物，在-50 ℃、10 Pa的條件下，冷凍干燥24 h，稱量得到一定質量的紅棗多糖，計算粗多糖得率。

1.5 多糖蛋白的脫除實驗

1.5.1多糖蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍G- 250法測定蛋白質的含量[7-8]。將紅棗多糖溶解于100 mL純水中，向試管中加入1 mL紅棗多糖溶液、5 mL G- 250蛋白試劑，振蕩均勻；2 min后，在595 nm波長處測吸光度，紅棗多糖中蛋白質質量濃度(mg/g)的計算見式(1)。

(1)

式(1)中，C為由樣品測定的吸光度代入回歸方程得到的蛋白質質量濃度，μg/mL；V為樣品提取液的總體積，mL；P為稀釋倍數；10-3為將μg換算成mg的轉換系數；W為稱取的紅棗粉質量，g。

1.5.2多糖蛋白脫除率的測定

蛋白質脫除率的計算見式(2)。

(2)

式(2)中，A0表示脫蛋白前樣品中蛋白質質量分數，mg/g；A1表示脫蛋白質后樣品中蛋白質質量分數，mg/g。

1.5.3多糖損失率的測定

紅棗多糖損失率的計算見式(3)。

(3)

式(3)中，B0表示脫蛋白前樣品中多糖質量分數，g/g；B1表示脫蛋白后樣品中多糖質量分數，g/g。

1.5.4多糖蛋白的脫除

1.5.4.1 Seveage法脫除

以m(紅棗多糖提取液)∶m(正丁醇與氯仿的混合液)=5∶1的比例，在紅棗多糖提取液中加入正丁醇與氯仿的混合液[V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶4]，混合均勻，用搖床震搖20 min，倒入分液漏斗中，靜置30 min，分液。重復進行3次，分別測定紅棗多糖提取液中和脫蛋白的紅棗多糖提取液中的蛋白質含量[7-8]，進行蛋白質的脫除率和紅棗多糖的損失率計算。

1.5.4.2 三氯乙酸法脫除

以m(紅棗多糖提取液)∶m(三氯乙酸)=1∶1.5的比例，在紅棗多糖提取液中加入體積分數為5%的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)水溶液，混合均勻，在冰箱中靜置4～6 h，在離心速度為4 000 r/min條件下離心15 min，除去沉淀，保留上清液，重復2～3次，進行蛋白質的脫除率和紅棗多糖損失率的計算。

1.5.4.3 CaCl2法脫除

在紅棗多糖提取液中用質量分數為2%的氫氧化鈉水溶液調節pH值為8，并加熱到85 ℃。將CaCl2加入提取液中，使其質量分數為5%，加熱攪拌30 min，待溶液冷卻至室溫后過濾，濾液用2 mol/L稀HCl調整pH值至7。將濾液離心后收集上清液，重復2～3次，進行蛋白質的脫除率和紅棗多糖的損失率計算。

2 結果與分析

2.1 多糖標準曲線方程的建立

分別吸取葡萄糖標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于大試管中，加入質量濃度為6%的苯酚溶液1 mL和硫酸5.0 mL，靜置5 min，于100 ℃的水浴鍋中水浴15 min，適當冷卻，然后在490 nm波長處測其吸光度。以葡萄糖含量質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立的多糖標準曲線方程為C=15.245A+0.0147(R2=0.999 0)。

2.2 蛋白質標準曲線方程的建立

分別吸取蛋白質標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，再分別吸取蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2及0.0 mL于試管中，最后在每個試管中加入5 mL考馬斯亮藍G- 250，混勻。按照1.5.1節方法建立蛋白質標準曲線。以蛋白質質量濃度(μg/mL)為橫坐標，其吸光度為縱坐標，建立的蛋白質標準曲線方程為y=15.245x+0.014 7(R2=0.990 3)。

2.3 多糖提取條件的優化結果

2.3.1單因素實驗優化結果

圖2 料液比對紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of jujube polysaccharide

2.3.1.1 料液比的影響

按1.4.1節進行單因素實驗，料液比對紅棗多糖提取率的影響結果見圖2。

由圖2可知，隨著料液比的降低，紅棗多糖在水溶液中的溶解度增加；但是當料液比達到1∶30 g/mL以后，紅棗多糖的提取率又呈現出下降的趨勢，這是由于溶劑和溶質之間的濃度差太大，反而會降低紅棗多糖在水中的溶解度，使紅棗多糖的提取率降低。因此當料液比為1∶30 g/mL時，紅棗多糖的提取率最高，為40.07%。

2.3.1.2 提取時間的影響

按1.4.1節進行單因素實驗，提取時間對紅棗多糖提取率的影響結果見圖3。

圖3 提取時間對紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield of jujube polysaccharide

由圖3可知，提取時間越長，多糖提取越充分。但是，當提取時間達到3 h后，則多糖結構會被破壞，因此導致多糖提取率下降。當提取時間為3 h時，紅棗多糖的提取率最高，為45.27%。

2.3.1.3 提取溫度的影響

按1.4.1節進行單因素實驗，提取溫度對紅棗多糖提取率的影響結果見圖4。

圖4 提取溫度對紅棗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of jujube polysaccharide

由圖4可知，紅棗多糖的提取率最初隨著溫度的升高而增加。這是因為隨著水浴溫度的升高，分子運動速度加快，因此多糖的提取率也增加。當溫度達到85 ℃以上時，紅棗多糖的提取率降低，因為過高的溫度會破壞多糖的結構。當提取溫度為80 ℃時，紅棗多糖的提取率最高，為45.53%。

2.3.2響應面試驗優化結果

通過單因素實驗，得到水提法提取紅棗多糖較佳單因素條件為料液比為1∶30 g/mL，提取溫度為80 ℃，提取時間為3 h。根據此條件設計3因素3水平的響應面試驗，確定提取紅棗多糖的最佳工藝條件，響應面試驗設計和結果見表1。

表1 多糖提取條件響應面試驗設計和結果Tab.1 Response surface experimental design and resultsof extraction conditions of ploysaccharides

利用Design expert軟件對表2數據進行擬合，得到提取率對以上三個因素的擬合回歸方程為多糖提取率=45.23+1.43×A+0.53×B-0.020×C+0.72×A×B+0.17×A×C-0.27×B×C-2.89×A2-1.31×B2-0.37×C2，對該模型進行方差分析，分析結果表明，回歸方程具有較高的擬合度和可信度，實驗誤差較小，表明模型的相關性非常好。回歸系數R2>0.9，自變量與響應值之間存在線性關系，因此，回歸方程可以進一步用來進行最佳提取工藝條件的優化，所以可以使用該模型來分析響應值的變化。根據回歸分析結果，作出響應面圖和等高線圖，見圖5。利用Design Expert軟件對提取紅棗多糖的最佳工藝條件進行預測，由圖5可知，紅棗多糖的較佳提取工藝條件是料液比為1∶30 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時間3 h，提取率為45.96%。

2.3.3驗證實驗

在響應面試驗得出的較優條件下進行3次平行實驗，測得的紅棗多糖提取率平均值為45.86%，與預測值基本相符。

2.4 紅棗多糖脫蛋白研究

2.4.1Seveage法脫除結果

用Seveage法進行紅棗多糖的脫蛋白實驗，脫蛋白前后蛋白質質量分數依次為5.91 mg/g和1.22 mg/g，蛋白質的脫除率為79.36%；脫蛋白前后多糖質量分數依次為0.46 g/g和0.35 g/g，紅棗多糖的損失率為23.91%。

2.4.2三氯乙酸法脫除結果

用三氯乙酸法進行紅棗多糖的脫蛋白實驗，脫蛋白前后蛋白質質量分數依次為5.91 mg/g和1.06 mg/g，蛋白質的脫除率為82.06%；脫蛋白前后多糖質量分數依次為0.46 g/g和0.39 g/g，紅棗多糖的損失率為15.21%。

2.4.3CaCl2法脫除結果

用CaCl2法進行紅棗多糖的脫蛋白實驗，脫蛋白前后蛋白質質量分數依次為5.91 mg/g和1.15 mg/g，蛋白質的脫除率為80.54%；脫蛋白前后多糖質量分數依次為0.46 g/g和0.37 g/g，紅棗多糖的損失率為19.56%。實驗結果表明，在3種多糖脫除蛋白的方法中，三氯乙酸法的蛋白脫除率最高，為82.06%，紅棗多糖的損失率也是最低的，為15.21%。

3 結 論

通過單因素實驗對水提法提取紅棗多糖的工藝條件進行了研究，得到的較佳提取條件是料液比1∶30 g/mL、提取時間3 h、提取溫度80 ℃。在單因素實驗的基礎上，采用響應面對紅棗多糖提取工藝條件進行研究，建立了提取率和各個因素之間的數學模型，得到了紅棗多糖提取的最佳工藝參數為m(紅棗)∶V(水)=1∶30 g/mL、提取時間3 h、提取溫度80 ℃，在此提取條件下，紅棗多糖的提取率為45.86%。

圖5 多糖提取響應面試驗優化結果Fig.5 Optimum results of polysaccharide extraction by response surface methodology

采用Seveage法、三氯乙酸法和CaCl2法3種方法對紅棗多糖進行了脫蛋白對比研究，結果表明，采用三氯乙酸法對紅棗多糖中蛋白質的脫除效果最好、多糖損失率最低，多糖蛋白的脫除率為82.08%，多糖損失率為15.21%。