天麻中香草醇對灰樹花菌絲體生物量和胞外多糖合成的影響

張宗啟，吳天祥,2，*，劉力萍

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院， 貴州 貴陽 550025；2.貴州食品工程職業學院， 貴州 清鎮 551400)

灰樹花(Grifolafrondosa)是近幾年開發出的一種藥食兼用真菌，隸屬于非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，又名貝葉多孔菌、栗子蘑、蓮花菌等。日本稱之為“舞茸”(maitake)，美國稱之為“林雞”(hen of the woods)[1]。近幾年研究表明，灰樹花多糖作為一種有效的生物免疫調節劑，具有明顯的抗腫瘤[2-3]、抗HIV病毒[4]、改善免疫系統功能[5]、治療皮膚病[6]、清除自由基等生理功能[7-8]。天麻(Rhizomagastrodiae)作為貴州三寶之一，是我國記錄最早和最重要的傳統草藥之一，其主要含有天麻素(gastrodiae，GA)、對羥基苯甲醛(p-hydroxylbenzaldehyde，HBA)、對羥基苯甲醇(p-hydroxybenzyl alcohol，HA)、香草醇(vanillyl alcohol，VA)和香草醛(vanillin，VL)等[9-10]。天麻及天麻提取物均可用于抗厥藥、鎮痛藥及預防全身麻痹、癲癇、眩暈、破傷風等[11]，由于其顯著的醫療效果，在許多國家被廣泛作為保健品使用。

近年來，國內外不少研究表明外源添加物可以促進真菌細胞生長和代謝產物的生成。畢澎洋[12]研究發現薏苡仁油和薏苡仁酯添加到靈芝發酵體系中會影響靈芝胞外多糖的分泌及其胞外多糖組分種類，其中2%薏苡仁油可以促進靈芝胞內、胞外多糖產量及靈芝酸含量，靈芝酸含量最高為對照組的4.04倍；Kim等[13]利用中藥牛蒡子提取物成分加入到灰樹花液體培養體系中，發現灰樹花發酵體系中的酶能將牛蒡子苷轉化為苷元，且加入牛蒡子提取物的灰樹花多糖有抗氧化活性；鄭浩然等[14]在靈芝發酵體系中添加鐵皮石斛，發現鐵皮石斛能促進靈芝胞外多糖的合成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對羥基苯甲醛、香草醇，美國Sigma公司；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、無水乙醇，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BXM- 30R型立式滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TS- 2102C型恒溫振蕩器，上海天呈實驗儀器制造有限公司；TDL- 40B型高速離心機，上海安亭科學儀器廠；SW- CJ- 1D型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；UV- 1800型雙光速紫外可見光光度計，上海欣茂儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測器、Agilent 5TC- C18色譜柱，美國Agilent公司。

1.3 培養方法

1.3.1灰樹花培養基配制

斜面種子培養基(PDA培養基，g/L)：馬鈴薯(去皮)200、葡萄糖20、蛋白胨2、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、瓊脂20，自然pH值。

液體種子培養基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨2、KH2PO40.5、MgSO4·7H2O 0.5、酵母膏6，自然pH值。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖50、蛋白胨5、KH2PO42、MgSO4·7H2O 2、酵母膏10，自然pH值。

1.3.2灰樹花培養

1)斜面種子培養。從長滿灰樹花菌絲體的母種試管中用接種鏟取黃豆粒大小的菌絲塊，接種于PDA培養基試管中部，放置于25 ℃恒溫培養箱，至菌絲體長滿整個斜面后，轉存于4 ℃條件下保藏使用。

2)液體種子培養。用接種勺取1勺長滿整個斜面的斜面種子培養基中的菌絲體，接種于液體種子培養基中。250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL，放入轉子后于旋渦震蕩機中震蕩5 min，將菌絲體打碎后于25 ℃、1 500 r/min搖床中培養7 d。

3)發酵培養。在無菌操作條件下，按10%的接種量，移液槍吸取10 mL液體種子培養基于發酵培養基中，250 mL錐形瓶中裝液量為100 mL，25 ℃、150 r/min培養12 d左右，至菌液中出現大量大小均勻的菌絲體球且菌液清亮。

1.4 天麻醇提物制備

天麻粉末制備：將新鮮天麻清洗干凈，去除泥土，切碎，60 ℃烘干粉碎后，過80目篩備用。

準確稱取20 g天麻粉末，加入200 mL體積分數為75%的無水乙醇，25 ℃條件下浸提48 h，過濾，旋轉蒸發除去乙醇，再加入200 mL蒸餾水重溶，即1 g天麻可得10 mL的醇提物，用于灰樹花液體發酵培養。

1.5 檢測方法

1.5.1生物量測定

灰樹花菌體生長情況以其菌絲體生物量為指標進行測定。將發酵培養基中菌絲體經8層紗布過濾，蒸餾水沖洗菌絲體3次后，于70 ℃數顯恒溫干燥箱中干燥，直至菌絲體恒重，記錄所得菌絲體質量。

1.5.2胞外多糖產量測定

灰樹花發酵體系中胞外多糖產量采用苯酚- 硫酸法進行測定[19]。發酵液超濾(截留量10 kDa)后旋轉濃縮至原體積的四分之一，再經透析(截留量7 000 Da)后，取適量發酵液于離心管內，加入4倍體積95%(體積分數)無水乙醇，于4 ℃條件下醇沉24 h后，6 000 r/min離心15 min，傾去上清液，沉淀加蒸餾水重溶，待測。

1.5.3香草醇含量測定

香草醇含量測定采用高效液相色譜法[20]。稱取香草醇3 mg，加入30 mL純凈水溶解，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的標準品溶液，待測。取1.5 mL發酵液過0.22 μm濾膜，待測。

檢測條件：色譜柱為Agilent TC- C18(4.6 mm×250 mm，10 μm)；流動相為0.1%磷酸水(流動相A)和乙腈(流動相B)；梯度洗脫為0～35 min，體積分數3%～30%乙腈；35～45 min, 體積分數30%～70%乙腈；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長221 nm。

1.6 數據處理

實驗數據采用Origin 9.0軟件繪圖，SPSS 19.0軟件分析顯著性，顯著性檢驗采用最小顯著差數法。

2 結果與分析

2.1 天麻醇提物成分分析

課題組前期研究表明，天麻醇提物滅菌前后的主要成分含量會發生改變，尤其是天麻素同巴利森苷之間的轉化，巴利森苷是由3個天麻素分子和1個檸檬酸分子連接而成[21]。選擇滅菌后的天麻醇提物進行香草醇含量測定實驗，測定結果如圖1。由圖1可知，天麻醇提物除了含有GA、HBA及HA以外，香草醇也是天麻醇提物的主要成分，出峰時間為14 min，經計算得滅菌后的7%天麻醇提物中香草醇含量為0.43 mg/g。

圖1 天麻醇提物和香草醇標準品的HPLC分析Fig.1 Analysis of R. gastrodiae alcohol extract and vanillyl alcohol standard by HPLC

2.2 香草醇對菌絲體生物量和EPS產量的影響

為了分析香草醇對灰樹花菌絲體生物量及EPS產量的影響及最佳添加量，在灰樹花深層發酵體系中加入0～300 mg/L的香草醇，發酵12 d后灰樹花菌絲體生物量及EPS產量的變化如圖2。由圖2可知，隨著香草醇質量濃度的增加，生物量與EPS產量均呈現出一定的先升高后降低的趨勢。這說明一定量的香草醇可以刺激深層發酵的灰樹花菌體，有利于菌絲體的生長和胞外多糖的分泌；但質量濃度過高會抑制菌絲體的生長，從而使得胞外多糖產量降低。當香草醇質量濃度為200 mg/L時，灰樹花菌絲體生物量與EPS產量均達到最大值，分別為(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，相較于空白組分別提高了21.1%和19.9%，且差異顯著(P<0.05)，故200 mg/L的香草醇為較佳添加量。

圖2 香草醇添加量對灰樹花菌絲體生物量 和EPS產量的影響Fig.2 Effect of vanillyl alcohol concentration on mycelial biomass and EPS production by submerged culture of G. frondosa

2.3 香草醇對發酵過程中菌絲體生物量和EPS產量的影響

將200 mg/L的香草醇和7%的天麻醇提物添加到灰樹花液體培養基中進行實驗，空白組中不加入任何外源添加物，測定天數為16 d，分析香草醇和天麻醇提物對灰樹花發酵過程中菌絲體生物量和EPS產量的促進作用，結果如圖3。在整個發酵過程中，生物量和EPS產量均呈先上升后趨近于平緩的趨勢。在發酵的前4 d，灰樹花菌種處于遲滯期，菌絲體生物量和多糖產量均較低且增長較緩慢，實驗組和空白組多糖產量增加趨勢較為接近；在第5～12天，灰樹花菌種處于對數生長期，菌絲體生物量和多糖產量呈明顯的上升趨勢，且香草醇實驗組明顯高于空白組，在這期間真菌灰樹花大量利用發酵體系中營養物質，供自身生長和EPS的分泌；發酵第13～16天，菌株處于穩定期，此時菌絲體生物量和胞外多糖產量趨于穩定，其中第14天，香草醇和天麻醇提物實驗組多糖合成量達到最大值，分別為(2.10±0.03) g/L和(2.39±0.03) g/L，均顯著高于空白組(P<0.05)。此外，實驗組在第14天后多糖增加較為平緩，這可能與生長環境和體系中營養物質的消耗有關。因此，培養最佳周期為14 d。本實驗灰樹花生物量和EPS產量變化趨勢與Wang等[17]研究結果基本一致，說明香草醇可以顯著地促進灰樹花菌絲體生物量和EPS的產生。

圖3 香草醇和天麻醇提物對灰樹花發酵過程中生物量和EPS產量的影響Fig.3 Effect of vanillyl alcohol and R. gastrodiae alcohol extract on mycelial biomass and EPS production during G. frondosa fermentation

2.4 發酵過程中香草醇含量變化分析

灰樹花深層發酵周期為14 d，選擇發酵第0天和第14天的發酵液進行高效液相色譜檢測，對比峰面積，推算發酵體系中香草醇含量的變化，從而確定灰樹花對香草醇的利用率，峰面積和香草醇含量結果見圖4和表1。結果表明，空白組(未添加天麻醇提物)沒有檢測到香草醇成分，而實驗組(添加7%天麻醇提物)顯示第0天和第14天的香草醇含量分別為0.41 mg/g和0.13 mg/g，降低了68.3%，這可能是香草醇作為含碳有機物被灰樹花利用，也可能是灰樹花體系中的酶將香草醇轉化為其他易于自身吸收利用的物質。黃忠等[22]研究發現，在灰樹花發酵周期中，天麻特征成分天麻素、對羥基苯甲醇和對羥基苯甲醛均會發生含量的變化，其中天麻素含量降低了47.86%，對羥基苯加醇降低了11.84%，對羥基苯甲醛含量降低了74.64%；結合本實驗發現，對羥基苯甲醛是灰樹花能夠最有效利用的物質，其次是香草醇、天麻素、對羥基苯甲醇。香草醇利用率的確定對天麻醇提物和天麻特征成分作用于灰樹花深層發酵提供了新的理論依據。

圖4 發酵第0天和第14天香草醇的HPLC分析Fig.4 Analysis of fermentation with vanillyl alcohol at 0th day and 14th day by HPLC

2.5 天麻醇提物、香草醇、對羥基苯甲醛對菌絲體生物量及EPS產量的影響分析

以200 mg/L香草醇為實驗對象，同7%天麻醇提物組、150 mg/L對羥基苯甲醛組及空白組對比灰樹花菌絲體生物量及EPS產量差異，結果如圖5。天麻醇提物對菌絲體生物量及EPS產量影響最大，其次為對羥基苯甲醛和香草醇實驗組，空白組最低。

表1 灰樹花發酵過程中香草醇含量變化Tab.1 Changes of vanillyl alcohol content during G. frondosafermentation

香草醇組的生物量為(1.40±0.02) g/L，與天麻醇提物組(1.58±0.03) g/L和對羥基苯甲醛組(1.51±0.03) g/L比較，分別降低了11.4%和7.3%，但較空白組(1.19±0.05) g/L提高了17.6%且差異顯著(P<0.05)；此外香草醇組胞外多糖產量為(2.28±0.02) g/L，同空白組(1.66±0.03) g/L相比，提高了37.3%且差異顯著(P<0.05)。這與吳彩云等[16]關于對羥基苯甲醛和7%天麻醇提物對灰樹花EPS生物合成促進作用的研究結果基本一致。因此，香草醇可以促進灰樹花菌絲體生長和胞外多糖的合成，但促進效果略低于天麻醇提物和對羥基苯甲醛。

圖5 天麻醇提物、香草醇和對羥基苯甲醛對灰樹 花生物量和EPS產量的影響Fig.5 Effect of R. gastrodiae extract, vanillyl alcohol and HA on mycelial biomass and EPS production by G. frondosa

灰樹花EPS合成與多糖合成酶作用相關，Vandamme等[23]及Wu等[24]研究表明：α-磷酸變位酶(α-phosphogluconate mutase,α-PGM)、磷酸葡萄糖異構酶(phosphogluconate isomerase, PGI)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)和dTDP-葡萄糖焦磷酸化酶(dTDP-glucose pyrophosphorylase, AGPase)是灰樹花多糖合成途徑和糖酵解途徑的關鍵酶，其中α-PGM和PGI是影響糖代謝進入多糖合成途徑的關鍵酶，而UGPase和AGPase是影響灰樹花多糖種類和單糖構成的關鍵酶；而Xu等[25]研究發現,天麻醇提物提高灰樹花體系中α-PGM酶活性，降低PGI酶活力；Tang等[26]研究發現，多糖的合成與α-PGM和PGI密切相關，其中α-PGM酶活力的提高與EPS合成呈正相關，而PGI酶活力的提高與EPS合成呈負相關，PGI酶活力提高會減少糖異生途徑(EPS合成途徑)的碳通量，不利于EPS的合成。

3 結 論

探究天麻醇提物主要成分香草醇對灰樹花深層發酵體系中菌絲體生物量及EPS產量的影響。通過高效液相色譜分析得出香草醇是天麻醇提物的主要成分，且灰樹花EPS產量達到最佳的發酵時間為14 d；第14天與第0天相比，香草醇利用率為68.3%，顯著高于對羥基苯甲醇和天麻素利用率，但低于對羥基苯甲醛的利用率。此外，當香草醇質量濃度為200 mg/L時，灰樹花生物量和EPS的產量達到最大值,分別為(1.47±0.02) g/L和(2.21±0.03) g/L，與對照組比較，分別提高了21.1%和19.9%。故香草醇對灰樹花生物量和EPS產量均有一定促進作用，但由于灰樹花深層發酵的作用，香草醇的羥基是否轉化為香草醛的羰基或其他物質，且香草醇對關鍵酶酶活力的影響同天麻醇提物相比是否存在顯著差異需要進一步的研究。