α-瓊膠酶OUC- GaJJ96的異源表達及酶學性質

金 佳，江承程，毛相朝,2,*

(1.中國海洋大學 食品科學與工程學院， 山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術國家試點實驗室/海洋藥物與生物制品功能實驗室， 山東 青島 266237)

瓊脂是從紅藻細胞壁中提取出來的一種重要多糖，由瓊脂糖和瓊脂膠組成[1]。瓊脂糖是由3,6-L-內醚半乳糖和D-半乳糖經α-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵交替連接組成的線性大分子多糖[2]，由于其物理性質獨特，在食品、醫藥等領域應用廣泛[3]。瓊脂膠與瓊脂糖結構類似，但瓊脂膠在羥基和伯醇基上不同程度地被硫酸基、丙酮酸、甲氧基、糖基等取代[2]。

瓊脂糖水解后生成的瓊膠寡糖具有許多生物功能，如抗氧化[4]、抗炎[5]、抗癌[6]和保濕美白[7]等，同時可作為益生元調節腸道菌群[8]。瓊膠寡糖的制備方法主要分為酸解法和酶解法兩種，相比于非特異性斷裂糖苷鍵的酸解法，酶解瓊脂糖可特異性斷裂糖苷鍵，產物更單一、條件更溫和。瓊膠酶在瓊脂糖酶解過程中具有重要作用，根據水解位點的不同，瓊膠酶可分為兩種類型：α-瓊膠酶(EC 3.2.1.158)和β-瓊膠酶(EC 3.2.1.81)。α-瓊膠酶可以水解α-1,3-糖苷鍵產生以D-半乳糖作為非還原性末端的瓊寡糖，β-瓊膠酶水解β-1,4-糖苷鍵產生以3,6-L-內醚半乳糖作為非還原性末端的新瓊寡糖[9]。

自瓊膠酶被發現以來，關于β-瓊膠酶克隆表達的研究較多，目前所表征的β-瓊膠酶涵蓋了GH16、GH50、GH86和GH118四個家族，研究較為深入。Ohta等[10]在2003年報道了第一個GH16家族的β-瓊膠酶AgaA，來源于食辛乳聚糖卓貝爾氏黃桿菌(ZobelliagalactanivoransDsiJT)；GH50和GH118家族的糖苷水解酶都屬于β-瓊膠酶，比如AgaB[11]、AgWH50C[12]、AgWH50B[13]等；Ohta等[14]在2004年報道了第一個GH86家族的β-瓊膠酶AgrA。目前有研究報道的α-瓊膠酶僅有5個，分別是來自溶藻性類單胞菌(AlteromonasagarlyticusGJ1B)的AgaA[15]，來自深海桿菌濟州居鹽菌(Thalassomonassp. 44 JAMB- A3)的AgaA33[16]，來自Thalassomonassp. LD5的AgaD[17]，來自卵鏈屬噬瓊膠卵鏈菌(Catenovulumagarivorans)的CaLJ96[18]以及來自卵鏈屬沉積物卵鏈菌(CatenovulumsediminisWS1- A)的AgaWS5[19]。α-瓊膠酶可用于偶數瓊寡糖的制備或可結合β-半乳糖苷酶進行奇數新瓊寡糖的制備。目前市場上可以購買到偶數新瓊寡糖和奇數瓊寡糖標品，但偶數瓊寡糖標品缺乏，所以尋找可用于制備偶數瓊寡糖的α-瓊膠酶具有重要意義。本研究擬在NCBI數據庫中，以已報道的α-瓊膠酶序列為模板進行序列比對，克隆表達得到一個α-瓊膠酶，探究其酶學性質和水解產物，希望為酶解瓊脂糖制備偶數瓊寡糖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(E.coli)DH5α、BL21(DE3)感受態細胞，北京天根生化科技公司；低熔點瓊脂糖，美國Sigma公司；瓊脂糖，美國Invitrogen公司；核酸染料Redsafe，韓國iNtRON公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉，英國Oxiod公司。其他未提及試劑均為國產分析純。

LB液體培養基：質量分數為1.0% NaCl、1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉。高壓滅菌條件為121 ℃，20 min。

LB固體培養基：在LB液體培養基的基礎上，加入質量分數為1.5%～2.0%瓊脂粉。高壓滅菌條件相同。

1.2 儀器與設備

5804R型高速冷凍離心機、Mastercycler nexus型PCR儀，德國艾本德股份公司；WD- 9405B型水平搖床、DYY- 6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；HH- 3A型水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；TGL16型離心機，長沙英泰儀器有限公司；MULTISKAN FC型酶標儀，賽默飛世爾科技公司；JY92- IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX型生化培養箱，新江南儀器有限公司；DW- 86L386型立式超低溫保存箱，青島海爾股份有限公司；GI80TW型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；LC- 20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；電噴霧離子源質譜，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1OUC- GaJJ96的克隆表達

在NCBI數據庫中，以已研究的α-瓊膠酶基因序列為模板進行檢索，根據序列相似性進行選擇，得到來源于溶藻性吉爾維菌(Gilvimarinusagarilyticus)的α-瓊膠酶基因(GenBank序列號：WP- 041525041.1)，克隆表達后得到α-瓊膠酶OUC- GaJJ96。在SMART(http:// smart. embl-heidelberg. de/)在線網站預測信號肽，結果表明，OUC- GaJJ96在N端含有26個氨基酸編碼的信號肽。利用SnapGene對刪除信號肽的基因序列進行引物設計，引物由青島擎科公司合成，引物序列分別為OUC- GaJJ96- F(5’-GGATCCATGGTTAACAGCAATACC-3’)，OUC- GaJJ96- R(5’-AAGCTTATGACTCAGTTCCAGAAT-3’)。基因片段經PCR擴增后與載體pET21a(+)連接，構建重組質粒pET21a(+)-OUC- GaJJ96。將轉化到E.coliBL21后的菌液于37 ℃培養16 h，挑取菌落接種到LB培養基中，采用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達。誘導結束后于4 ℃，8 000 r/min離心15 min，收集菌體。

1.3.2OUC- GaJJ96的純化

選用20 mmol/L，pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液將菌體重懸，完全復溶后在低溫下超聲破碎(功率360 W，30 min)，破碎結束后于4 ℃，8 000 r/min離心15 min，取上清液即為粗酶液。純化所用填料為ProteinIso?Ni- NTA Resin，純化過程中所用的緩沖液、相關溶液以及粗酶液均用0.45 μm濾膜過濾，純化操作均在4 ℃進行。先用六倍柱體積的平衡緩沖液(20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、10 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl)平衡柱子；上樣后依次用含有不同咪唑濃度梯度(20、50、80、120、200 mmol/L)的洗脫緩沖液洗脫柱子，并分別對粗酶液及純化后酶液進行SDS- PAGE檢測。

1.3.3OUC- GaJJ96酶學性質的表征

1.3.3.1 OUC- GaJJ96酶活力的測定

采用DNS法進行酶活力測定[20]。吸取193 μL，質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物(pH值為7.0，50 mmol/L Tris- HCl緩沖液配制)，5 μL純化后的酶液和2.0 μL 1 mol/L的Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃反應30 min，沸水浴5 min終止反應。取200 μL反應液與300 μL DNS沸水浴5 min，冷卻至室溫，于540 nm測定吸光值。以滅活后的酶液作對照，每個反應做3個平行。

α-瓊膠酶酶活力單位(U)的定義：每分鐘水解瓊脂糖產生1 μmol還原糖所需要的酶量。

1.3.3.2 最適溫度和熱穩定性的測定

1)OUC- GaJJ96最適溫度的測定。將用pH值為7.0的Tris- HCl緩沖液配制的質量分數為0.3%的瓊脂糖底物在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃條件下溫育10 min。分別吸取190 μL溫育后的底物，10 μL純化后的酶液和2.5 μL 1 mol/L的Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃反應30 min，沸水浴5 min終止反應。用DNS法測定酶活力，以最大值為100%，分別計算各溫度下的相對酶活力，每個反應做3個平行。

2)OUC- GaJJ96熱穩定性的測定。取適量純化后的酶液在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃條件下放置，按不同時間取樣，在最適反應條件下測定酶活力。以未經處理的酶液作對照，計算不同處理下的殘余酶活力，每個反應做3個平行。

1.3.3.3 最適pH值和酸堿穩定性的測定

1)OUC- GaJJ96最適pH值的測定。分別用50 mmol/L的pH值為3.0～6.0的檸檬酸鹽緩沖液，50 mmol/L的pH值為6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，50 mmol/L的pH值為7.0～9.0的Tris- HCl緩沖液和50 mmol/L的pH值為9.0～10.0的甘氨酸- NaOH緩沖液，配制質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物，煮溶后于30 ℃條件下溫育10 min。吸取190 μL溫育后的底物，10 μL純化后的酶液和2.5 μL 1 mol/L的Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃條件下反應30 min，沸水浴5 min終止反應。用DNS法測定酶活力，以最大值為100%，分別計算不同pH值條件下的相對酶活力，每個反應做3個平行。

2)OUC- GaJJ96酸堿穩定性的測定。取適量純化后的酶液于pH值為6.0～10.0的緩沖液中，在4 ℃條件下放置，按不同時間取樣，在最適反應條件下測定酶活力。以未經處理的酶液作對照，計算不同處理下的殘余酶活力，每個反應做3個平行。

1.3.4OUC- GaJJ96水解產物分析

1.3.4.1 高效液相色譜分析

1)高效液相色譜(HPLC)分析條件[13]。Sugar Pak I色譜柱(6.5 mm×300 mm，10 μm)。流動相為50 mg/L的乙二胺四乙酸二鈉鈣鹽(EDTA- CaNa2)，設置柱溫為75 ℃，流速為0.5 mL/min，示差折光(RID)檢測器檢測。

2)樣品制備。吸取190 μL質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物，10 μL純化后的酶液和2.5 μL 1 mol/L的Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃條件下反應，按不同時間取樣，沸水浴5 min終止反應。將反應后的溶液過0.22 μm濾膜后于4 ℃保存，作為后續HPLC分析樣品。吸取190 μL質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物，10 μL純化后的酶液和2.5 μL 1 mol/L Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃條件下反應24 h，不終止反應，補加β-半乳糖苷酶AgWH2A[21]，在其最適反應溫度(40 ℃)下充分反應20 h，沸水浴5 min終止反應。將反應后的溶液過0.22 μm濾膜后于4 ℃保存，作為后續HPLC分析樣品。

3)標品制備。由于市場上缺乏偶數瓊寡糖標品，所以選用已有較深入研究的CaLJ96[19]反應產物作標品。吸取190 μL質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物，10 μL純化后的CaLJ96和2.5 μL 1 mol/L的Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃條件下反應12 h，沸水浴5 min終止反應。將反應后的溶液過0.22 μm濾膜后于4 ℃冰箱保存，作為后續HPLC分析標品。

1.3.4.2 電噴霧離子源質譜分析

1)電噴霧離子源質譜(ESI- MS)分析條件[18]。采用負離子掃描模式，全掃描質荷比(m/z)為100～1 000。

2)樣品制備。吸取190 μL質量分數為0.3%的低熔點瓊脂糖底物，10 μL純化后的酶液和2.5 μL 1 mol/L Ca2+于1.5 mL EP管中，混合后于30 ℃條件下反應24 h，沸水浴5 min終止反應。將反應后的溶液過0.22 μm濾膜后于4 ℃保存，作為后續ESI- MS分析樣品。

1.4 數據處理

采用Origin Pro 9.0軟件進行數據統計和圖片處理，數據均為3次平行。

2 結果與分析

2.1 OUC- GaJJ96的序列分析結果

OUC- GaJJ96的開放閱讀框(ORF)總長度為3 759 bp(GenBank序列號WP_041525041.1)，編碼1 252個氨基酸。將OUC- GaJJ96與已報道的5個α-瓊膠酶序列進行比對，結果顯示：OUC- GaJJ96與來自ThalassomonasagarivoransJAMB- A33的AgaA33[16]序列同源性最高，為58.81%(GenBank序列號BAF44076.1)，與來自AlteromonasagarlyticusGJ1B的AgaA[15](GenBank序列號AAF26838.1)序列同源性為57.51%，與來自Thalassomonassp. LD5的AgaD[17](GenBank序列號AQN80853.1)序列同源性為56.44%，與來自Catenovulumagarivorans的CaLJ96[18](GenBank 序列號WP_035015824.1)序列同源性為57.92%，與來自CatenovulumsediminisWS1- A的AgaWS5[19](GenBank序列號WP_143872330.1)序列同源性為52.78%。OUC- GaJJ96的進化樹分析結果見圖1。圖1顯示：OUC- GaJJ96同之前報道的α-瓊膠酶都屬于GH96家族，但OUC- GaJJ96屬于該家族的一個獨立分支，說明它是一種較為新型的α-瓊膠酶。

圖1 OUC- GaJJ96進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of OUC- GaJJ96

2.2 OUC- GaJJ96蛋白的表達及純化結果

將用于表達的菌株接入LB培養基中，培養至OD600達到0.6左右時加入IPTG誘導培養20 h，收集并破碎菌體制備粗酶。通過DNS法初步測定粗酶活力，與滅活的酶液相比，粗酶顯示出較高的酶活力，可用于進一步純化。經過鎳柱純化得到目的蛋白OUC- GaJJ96。酶活力測定結果顯示：OUC- GaJJ96比酶活力為2.68 U/mg。OUC- GaJJ96蛋白的SDS- PAGE電泳結果見圖2。圖2顯示：目的蛋白分子質量約為180 kDa，DNAMAN預測蛋白分子質量為136.1 kDa。

M：標準蛋白Marker；1：粗酶蛋白；2：純化的蛋白。圖2 OUC- GaJJ96蛋白純化的SDS- PAGE分析結果Fig.2 SDS- PAGE analysis of OUC- GaJJ96

2.3 酶學性質分析

圖3 溫度和pH值對酶活力的影響Fig.3 Influence of temperature and pH on enzyme activity

OUC- GaJJ96酶學性質研究結果見圖3。圖3(a)及圖3(b)表明：OUC- GaJJ96在30 ℃、pH值為7.0(Tris- HCl緩沖液)的環境中表現出最高酶活力，與已報道的α-瓊膠酶相似。Lee等[19]報道的α-瓊膠酶AgaWS5在40 ℃、pH值為8.0的環境中表現出最高酶活力，且具有獨特的耐寒性，在10 ℃可保留超過40%的最高酶活力；Liu等[18]報道的α-瓊膠酶CaLJ96最適反應溫度和pH值分別為37 ℃、7.0；Ohta等[16]報道的α-瓊膠酶AgaA33最適反應溫度和pH值分別為45 ℃、8.5，可在40 ℃環境中30 min內保持穩定；Potin等[15]報道的α-瓊膠酶AgaA最適反應溫度和pH值分別為42.5 ℃、7.2，在低于30 ℃的環境中保存幾天后仍有酶活力，溫度超過45 ℃或pH值低于6.5均會失活；Zhang等[17]報道的α-瓊膠酶AgaD最適反應溫度和pH值分別為35 ℃、7.4。圖3(c)熱穩定性研究結果表明：OUC- GaJJ96在高于35 ℃放置30 min幾乎完全失活，在25 ℃及30 ℃放置30 min可分別保持初始酶活力的87.9%、37.04%，在高于30 ℃條件下放置1 h幾乎完全失活。圖3(d)酸堿穩定性研究結果表明：OUC- GaJJ96在4 ℃，pH值為6.0的環境中放置12 h基本失去活性；在4 ℃，pH值為10.0的環境中放置12 h可保持初始酶活力的50.64%；在pH值為7.0條件下最穩定。

2.4 OUC- GaJJ96的水解產物分析

由于市場上缺乏偶數瓊寡糖標品，以有較深入研究的α-瓊膠酶CaLJ96[18]與瓊脂糖反應產物作為標品，通過HPLC對不同時間取樣的樣品進行檢測，并進一步通過ESI- MS分析產物。OUC- GaJJ96水解產物的HPLC檢測結果見圖4。圖4(a)表明：隨著反應的進行，P1、P2和P3的含量呈現遞增趨勢，且主要產物為P2。由于偶數瓊寡糖與偶數新瓊寡糖的分子質量一致，無法根據分子質量判斷產物是偶數瓊寡糖還是新瓊寡糖。考慮到β-半乳糖苷酶只切割瓊寡糖非還原端的糖苷鍵，將其降解生成D-半乳糖和相應的新瓊寡糖，因此選擇對OUC- GaJJ96水解瓊脂糖的產物進行再解析。圖4(b)表明：在OUC- GaJJ96的水解產物中補加β-半乳糖苷酶反應后，出峰時間發生了偏移，說明β-半乳糖苷酶AgWH2A可以繼續降解OUC- GaJJ96的水解產物。OUC- GaJJ96水解產物的ESI- MS檢測結果見圖5。圖5表明：產物分子質量P1為936 Da，P2為630 Da，P3為324 Da。進一步結合Liu等[18]的研究結果分析得出，產物P1為瓊六糖，P2為瓊四糖，P3為瓊二糖。其他已報道的α-瓊膠酶AgaWS5[19]、CaLJ96[18]、AgaA33[16]、AgaA[15]及AgaD[17]主要水解產物均為瓊四糖，OUC- GaJJ96的主要水解產物與其相同。

圖4 OUC- GaJJ96水解產物的HPLC分析結果Fig.4 HPLC analysis of hydrolysis products of agarose hydrolyzed by OUC- GaJJ96

圖5 OUC- GaJJ96水解產物ESI- MS分析結果Fig.5 ESI- MS analysis of hydrolysis products of agarose hydrolyzed by OUC- GaJJ96

3 結 論

克隆表達了來自Gilvimarinusagarilyticus的α-瓊膠酶OUC- GaJJ96。OUC- GaJJ96屬于GH96家族，蛋白分子質量約為180 kDa，比酶活力為2.68 U/mg，在30 ℃、pH值為7.0(Tris- HCl緩沖液)條件下顯示出最高酶活力，主要水解產物為瓊四糖。OUC- GaJJ96除可用于偶數瓊寡糖標品的制備外，參考β-瓊膠酶與α-新瓊二糖水解酶結合制備奇數低聚合度瓊寡糖的方法及Yang等[21]的研究，可將OUC- GaJJ96與β-半乳糖苷酶AgWH2A結合制備奇數新瓊寡糖。通過對OUC- GaJJ96最適反應溫度和pH值的考察，得到最佳反應條件，結合水解產物研究，充分了解其酶解性質，希望能豐富α-瓊膠酶酶庫，并能為偶數瓊寡糖的生物酶法制備提供理論基礎。