食管癌高危人群篩查的MDM2-BRCA2-MGMT自身抗體聯合檢測試劑盒研究

魏夢霞，雷玲玲，李學民，韓文莉，趙學科，孟超龍，胡守佳，程 錕,3，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉,3，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，吉佳佳，王偉鵬，王立東

食管癌(esophageal cancer,EC)是一種極具中國特色的惡性腫瘤，全球每年新發57.2萬例，2/3發生在中國[1]，2015年中國食管癌發病率和死亡率均居消化道惡性腫瘤第二位[2]。臨床發現早期食管癌患者較少，95%患者就診時已為中晚期癌，5 a生存率僅為15%～20%[3]而臨床就診早期癌患者5 a生存率可達90%。篩選和建立用于大范圍無癥狀人群早期發現和高危人群預警的指標和方法，是提高食管癌早期發現率，降低食管癌死亡率的關鍵解決措施[4]。癌細胞在其發生和發展過程中會合成并釋放出一組其特有的分泌性抗原，即腫瘤相關抗原，因而患者血清中可能會存在這些抗原對應的自身抗體，因此檢測患者血清中的自身抗體有助于癌癥病人高危人群預警和篩查[5]。同時，相關研究表明，腫瘤具有異質性，即使同一腫瘤也可能有不同的抗原表達。目前，人們尚未找到針對某一腫瘤的單一分子標志物，因此，與單個自身抗體檢測方法相比，用多種腫瘤相關抗原聯合檢測患者體內自身抗體的表達情況，有利于提高針對某一腫瘤的檢出率。近年研究發現了一組食管癌特異相關蛋白分子指標(MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白等)[6-7]，利用這些變異分子進行優化組合對食管癌高危人群進行分子學檢測，并利用液體活檢技術首先確定無癥狀人群中的高危人群，再對這些高危人群進行色素內鏡和黏膜靶向活檢及病理學檢查，是食管癌高發區大規模無癥狀人群癌前病變和早期癌篩查的重要策略之一。本研究采用自身抗體篩查技術對食管癌高發區無癥狀食管癌人群進行篩查應用，為無癥狀食管癌高危人群預警篩查提供重要依據。現報道如下。

1 材料和方法

1.1 分子指標優化組合ELISA試劑盒制備

1.1.1 第一組400例人群血清樣本檢測

ELISA試劑盒組成：MDM2、BRCA2和MGMT抗原包被的96孔酶標板；樣品稀釋液：含有1%(W/V)BSA的PBST緩沖液；第二抗體稀釋液：含有1%(W/V)BSA的PBST緩沖液；酶標抗原：辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體(Invitrogen公司)；顯色液：顯色液由顯色液A和顯色液B組成，其中，顯色液A為0.02%(W/V)TMB，顯色液B為0.006%(W/V)過氧化脲素；使用時將顯色液A和顯色液B按照1∶1等體積混合均勻；終止液：10%的硫酸；洗滌液：pH7.4的0.01 M的PBST(磷酸鹽)緩沖液；陽性對照血清：MDM2(BRCA2或MGMT)陽性對照血清；陰性對照血清：MDM2(BRCA2或MGMT)陰性對照血清，以上樣品分別包裝后與抗原包被的96孔酶標板構成食管癌早期篩查ELISA試劑盒。

取樣品血5 mL于10 mL離心管中，室溫靜置30 min后，2 000 r·min-1離心15 min，分離上層血清樣本0.1 mL并加入樣本稀釋液(1∶500稀釋，V/V)，將稀釋后的血清樣本加入已被抗原包被的96孔酶標板反應孔中，每個孔的樣本添加量為0.1 mL，37 ℃孵化1 h，棄去反應孔中液體，洗滌液洗滌5次以上。

辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體中加入第二抗體稀釋液(1∶40 000，V/V)，取0.1 mL加入96孔酶標板反應孔中，37 ℃孵化50 min，棄去反應孔中液體，洗滌液洗滌5次以上。

A顯色液和B顯色液等體積混合后取0.1 mL迅速加入至96孔酶標板反應孔中，37 ℃避光孵化15 min，加入終止液0.05 mL，20 min內于檢測波長450 nm和參比波長595 nm測定OD值，并用空白對照孔調零。

以陰性對照孔所測OD值得平均數加兩個標準差(Mean+2SD)為截斷值(cut-off值)，反應孔中OD值讀數大于等于截斷值判斷為陽性，反應孔中OD值讀數小于截斷值的判斷為陰性。

1.1.2 研究樣本信息收集正常人血清200份(對照組)和早期食管癌患者血清200份(食管癌組)，樣本來自于省部共建食管癌防治國家重點實驗室5.4萬樣本庫。對照組樣本人群男女比例1∶1，年齡(60±8)歲，該血清來自該重點實驗室合作意愿體檢中心的健康體檢人群，無腫瘤相關證據；食管癌組樣本人群男女比1∶1，年齡(52±10)歲，實驗組血清樣本均經組織病理學證實為早期食管癌(0期和Ⅰ期)。

1.1.3 樣本處理對照組和食管癌組居民靜脈取血5 mL，室溫下靜置30 min后，2 000 r·min-1離心15 min，分離上層血清樣本0.1 mL，液氮保存12 h內轉入實驗室，-80 ℃冰箱儲存。

1.2 第二組403例無癥狀人群篩查驗證

1.2.1 研究樣本在食管癌高發區河北省邯鄲磁縣，對志愿接受體檢的無癥狀居民進行流行病學調查，其中參與調查和體檢的居民共403人，男性212人，年齡(53±10)歲；女性191人，年齡(53±10)歲。流行病學調查前先由當地村干部和鄉村醫生幫助發放和講解知情同意書，對同意接受檢查的人開始詢問家族病史并進行體檢，填寫基本信息調查表，包括各種腫瘤的家族史。所有被檢者均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響蛋白表達的疾病。

1.2.2 食管癌早期篩查對上述403例無癥狀居民靜脈取血5 mL，樣本處理步驟同1.1.3。對每個血清樣本進行血清學檢測，具體檢測步驟同1.1.1。

1.2.3 組織病理學檢測對上述403例無癥狀人群血清學檢測陽性和陰性居民均進行色素內鏡檢查，并在常規的食管上段、中段和下段取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變部位取材，必要時進行食管黏膜碘染色，在食管不染區取材，所有活檢組織均迅速置85%乙醇固定。對色素內鏡所取活檢組織全部固定、脫水、切片、HE染色，做組織病理學診斷。

1.3 第三組19 415例人群大規模篩查

1.3.1 研究樣本1973年以來，河北省多家城鄉醫院包括河北醫科大學第四醫院等對磁縣食管癌高發區長期堅持下鄉普查，建立了多個腫瘤防治點，自2011年以來，對19 415例30～70歲無癥狀人群進行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，其中男性9 615人，年齡(56±11)歲，女性9 800人，年齡(56±11)歲。

1.3.2 食管癌早期血清篩查對上述19 415例無癥狀人群進行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，發現3 980例高危人群(20.50%，3 980/19 145)和15 435例非高危人群，對該3 980高危人群進行色素內鏡檢查，取活體組織，并進行組織病理學診斷。3組樣本食管癌患者早篩過程如圖1所示。

圖1 食管癌患者早篩流程圖

2 結果

2.1 食管早期篩查ELISA試劑盒血清檢測3種自身抗體在食管癌組和對照組中的血清抗體檢測結果如表1所示。檢測后，食管癌組患者血清MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗體水平顯著高于對照組。食管癌組MGMT抗體表達陽性占13.75%，對照組MGMT抗體表達陽性占3.25%，食管癌組MDM2抗體表達陽性占18.50%，對照組MGMT抗體表達陽性占3.75%，食管癌組BRCA2抗體表達陽性占19.25%，對照組BRCA2抗體表達陽性占3.75%；3種自身抗體相比較，BRCA2抗體在食管癌組中的表達率明顯高于MDM2抗體，MGMT抗體表達率最小；在食管癌組中，單一自身抗體表達陽性的人數明顯低于陰性人數，MGMT抗體表達陽性占13.75%，MGMT抗體表達陰性占36.25%；3種自身抗體OR值均大于1，表明MDM2蛋白、BRCA2蛋白和MGMT蛋白抗體三者均為患病的危險因素；P<0.001(SPASS 20.0)表明差異有統計學意義。

表1 3種自身抗體在食管癌組和對照組中的血清抗體檢測 例(%)

2.2 3種腫瘤相關抗體組合檢測結果3種腫瘤相關自身抗原自身抗體檢測結果如表2所示，可以看出隨著組合數目的增多，檢測靈敏度隨之升高，特異度不斷降低；3種自身抗體組合檢測靈敏度最高，高達89.50%，表明3種自身抗體組合檢測正確診斷為食管癌的概率為89.50%；3種指標結合時檢測特異度仍能達到89.50%，表明非食管癌患者采用3種指標聯合檢測時，被正確診斷為未患食管癌的概率為89.50%；采用MGMT、MDM2和BRCA2這3種腫瘤相關抗原自身抗體組合進行食管癌早期診斷，在保證診斷特異度的前提下大幅度提高了診斷靈敏度；約登指數隨著腫瘤相關抗原組合數目的增多逐漸增大，趨于1，表明3種腫瘤相關組合指標用于診斷腫瘤價值較大，該方法診斷和早期篩查食管癌應用價值較高；采用MGMT、MDM2和BRCA2這3種腫瘤相關抗原自身抗體組合聯合檢測方法優化組合，對食管癌高危人群進行血清自身抗體檢測，首先確定無癥狀人群中的高危人群，既能保證較高的特異度，又能提高診斷靈敏度，對評估待測對象患食管癌的風險具有較好的診斷和應用價值。

表2 3種腫瘤相關抗原抗體檢測結果 例(%)

2.3 403例人群血清學和組織學檢測第二組高發區403例無癥狀人群年齡和性別分布如表3所示，男性總人數(205例)略高于女性總人數(199例)；無論是男性還是女性，主要年齡均分布在50～59歲，其次為60～69歲、40～49歲。對403例無癥狀人群進行食管有色內鏡檢查和食管上皮組織活檢，其中至少有一種自身抗體陽性者90例，3種自身抗體均為陰性者313例。此次403例無癥狀人群均自愿接受有色內鏡檢查和食管上皮組織活檢，結果發現403例無癥狀人群中食管上皮正常346例，癌前病變41例。檢出早期食管癌14例，其中13例在自身抗體陽性組；檢出其他腫瘤2例，分別是自身抗體陽性組1例和自身抗體陰性率1例。自身抗體陽性組和自身抗體陰性組的色素內鏡檢查結果見表4。

表3 第二組高發區403例無癥狀人群食管癌早篩年齡性別分布 例(%)

表4 403例無癥狀人群血清自身抗體表達對比及食管內鏡活檢病理人數結果 例(%)

2.4 第三組河北磁縣19 415例無癥狀人群食管癌早期篩查情況河北醫科大學第四醫院與磁縣人民醫院聯合承擔國家“十一五”重大科技支撐項目“食管癌早診早治普查工程”，自2011年起，共對19 415例無癥狀人群進行食管癌高危人群和早期癌液體活檢篩查，共發現3 980例高易感人群(20.5%，3 980/19 145)；對這些高危人群進一步進行色素內鏡和黏膜活檢病理檢查，共發現1 553例癌前病變患者；626例上消化道腫瘤患者，包括582例食管癌和44例其他消化道腫瘤；582例食管癌患者中，早期食管癌占86.6%(504/582)。

3 討論

本研究通過檢測血清中3種食管癌相關抗原(MDM2、BRCA2和MGMT)，探討血清學檢測作為高危人群和早期食管癌篩查的可能性。本研究的優勢在于，利用間接酶聯免疫吸附法對食管癌組和對照組進行3種血清自身抗體檢測，發現3種血清自身抗體聯合檢測時其敏感性和特異性最優，均為89.50%。本研究又在食管癌高發區對403例無癥狀人群行聯合血清自身抗體檢測，且對所有受試者行色素內鏡檢測，提示多種食管癌相關抗原自身抗體聯合色素內鏡和黏膜活檢病理學檢查可能是食管癌高發區無癥狀高危人群和早期發現的重要技術。本研究在食管癌高發區對19 415例無癥狀人群進行大規模篩查，并對血清學檢查陽性受試者行色素內鏡檢查，證實多種食管癌相關自身抗體聯合色素內鏡和黏膜活檢病理學檢查可以有效檢出食管癌高危人群和早期癌，并且減少了內鏡篩查范圍，降低了篩查成本，易于被受檢者接受。

本研究中的3種血清自身抗體是根據本實驗室或其他研究報道而選擇的，這些報道與食管癌都密切相關[8-10]，但其機制與自身抗體有關血清中的表達尚不明確。有關研究表明，頭頸部、肺癌等許多腫瘤都和血清中自身抗體的過表達密切相關[11-12]。在食管癌中，P53、C-myc、Koc等腫瘤相關自身抗體已被在血清中聯合檢測[4,13]，因此，優化組合的血清自身抗體可用于篩查和早期診斷。

本研究基于MDM2、BRCA2和MGMT這3種優化組合的血清自身抗體聯合色素內鏡和黏膜活檢病理學檢查進行病例對照研究，證實了該技術具有被廣泛推廣應用的價值。單純血清自身抗體篩查容易出現假陽性，且不是臨床診斷食管癌的金標準。單純色素內鏡和黏膜活檢病理學篩查范圍大、成本高，“陪伴檢查”現象嚴重，受試者不舒服且拒絕檢查，還需要經驗豐富的內窺鏡醫師[14]。因此，建立一種快速、經濟、患者可接受的篩查技術，首先篩查高危人群，然后進一步進行內鏡檢查確定食管癌高危人群和早期癌是非常重要且必要的。

本研究結果表明，腫瘤相關抗原自身抗體的組合可以顯著提高食管癌和高危人群篩查的敏感性和特異性。應用這3種食管癌相關抗原自身抗體篩查河北磁縣食管癌高發區19 415例人群，通過對血清自身抗體陽性人群色素內鏡精準檢查，發現早期食管癌2.60%，相較于傳統內鏡篩查早期癌患者的發現率2.00%～3.00%有所提高[15]，并且色素內鏡檢查人群大幅度縮小，節省了大量普查工作的人力、物力和財力。更重要的是，利用該技術，可以精確篩出無癥狀的高危人群，能夠更精準地進行早防、早診和早治，提高早期食管癌的檢出率，延長食管癌患者的生存期，具有巨大潛在的社會效應，非常值得推廣應用。