STK15、P15和MLH1腫瘤相關抗原自身抗體液體活檢用于食管癌高危人群篩查研究

胡景峰，宋 昕，高社干，王 偉，3，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學科，孟超龍，胡守佳，程 錕,3，王盼盼，鐘 侃，孔國強，王立東

食管癌預后較差，中晚期患者術后5 a生存率僅為10%左右[1]，而手術切除治療的早期食管癌5 a生存率超過95%[1-2]。食管癌早期診斷和治療可以極大地延長患者生存時間，但早期食管癌患者無特異癥狀，就診時多已處于晚期，早期檢出率不足2%[3]。食管癌高危人群預警篩查和早期發現是降低食管癌發病率和死亡率的關鍵[3]。腫瘤相關抗原是一種發展迅速的腫瘤標志物，是在惡性腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成分泌的或是由機體對腫瘤反應而異常產生和/或升高的，可以刺激機體產生自身抗體，反映腫瘤存在和生長的一類物質，為食管癌無創性液體活檢技術的研發提供了重要檢測指標[4-5]。利用檢測腫瘤相關抗原自身抗體的液體活檢技術篩查無癥狀高危人群和早期浸潤食管癌是目前食管癌防治研究領域的重要研究課題之一[6-13]。本研究利用液體活檢篩查技術，進行病例對照研究，并在高發區驗證，評價液體活檢技術在食管癌高危人群預警篩查和食管癌早期發現中的意義。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象分為3組人群。第一組為來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室200份血清樣本，其中無任何腫瘤相關的證據正常人血清100份(正常組)，早期食管癌患者血清100份(食管癌組)。利用間接酶聯免疫法對兩組人群檢測腫瘤相關抗原自身抗體STK15、P15和MLH1的表達情況。 第二組為在食管癌高發地區河南省新鄉市某地做流行病學調查，對自愿接受血清學自身抗體檢查和色素內鏡檢查的35歲無癥狀居民行相關檢查。第三組為2014至2019年在食管癌高發地區河南省洛陽市某地食管癌篩查參與人群，對自愿接受血清學自身抗體檢查的35歲以上無癥狀居民行相關檢查。對血清學檢查陽性者，經受試者同意后行色素內鏡和黏膜病理檢查。

1.2 實驗方法

1.2.1 流行病學調查在當地政府人員和醫生的幫助下，為當地居民講解知情同意書，并幫助居民填寫基本信息表。對自愿接受檢查的受試者排除患有傳染病、過敏及體質較差者。

1.2.2 血樣采集與保存分別對每位受試者取空腹靜脈血5 mL，置于離心管內，在室溫下靜置30 min后以2 000 r·min-1離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，干冰保存，限時轉至實驗室-80 ℃冰箱內儲存備用。

1.2.3 自身抗體測定實驗方法為本實驗室已建立的間接酶聯免疫吸附法[14]。

1.2.4 血清檢測結果判定采用Scripps研究所判定方法，Cut-off值(截斷值)取正常血清OD讀數的均數±3個標準差，讀數大于截斷值為陽性，否則為陰性[15]。有一項自身抗體表達陽性時，該受試者定義為食管癌高危人群。

1.2.5 胃鏡檢查常規行食管黏膜碘染色和賁門黏膜美藍染色，在食管不染區取材，所有活檢組織均迅速置于85%乙醇內固定。

1.2.6 病理組織學檢查對胃鏡獲取的活檢組織常規處理后切片，每張厚5 μm，HE染色，作組織病理學診斷。

2 結果

2.1 研究流程對來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室收集的100份早期食管癌患者和100份正常人的血清進行檢測；在食管癌高發地區河南省新鄉市某地作流行病學調查，有457位無癥狀居民接受了血清學檢測，457例接受了血清學檢查的居民中有52例拒絕接受色素胃鏡檢查，共405例受試者接受了色素胃鏡和黏膜病理檢查；在食管癌高發區河南省洛陽市作食管癌大規模篩查，共對16 212例35歲以上無癥狀人群行血清學腫瘤相關抗原自身抗體篩查，共有3 512例受試者發現3種自身抗體有至少1種陽性，在這3 512例血清學檢查陽性的受試者中，有416例拒絕接受胃鏡檢查，共3 096例受試者接受了色素胃鏡和黏膜病理檢查。

2.2 流行病學調查情況第一組100例正常人中，男性49例，女性51例，年齡35～69(52.47±9.87)歲；100例早期食管癌患者中，男性54例，女性46例，年齡40～78(60.87±7.65)歲。第二組同時接受血清學檢查和色素內鏡檢查者共405例，其性別、年齡分布見表1。第三組共有無癥狀受試者16 212例，其中男性8 125例，年齡30～87(52,32±10.49)歲；女性8 087例，年齡30～91(53.02±10.49)歲。

表1 第二組受檢對象年齡與性別分布 例(%)

2.3 腫瘤相關抗原自身抗體檢查結果3種腫瘤相關抗原自身抗體在食管癌組和正常組中的表達差異明顯，見表2；3種自身抗體聯合檢測區分食管癌組和正常組有較高的敏感度和特異性，見表3。

表2 3種自身抗體在早期食管癌患者和健康志愿者血清中表達差異分析

表3 不同自身抗體組合聯合檢測結果

2.4 血清學和胃鏡檢查結果對比第二組研究對象中，有405名無癥狀人群同時接受血清學檢查和色素內鏡檢查，有87例血清學檢查抗體陽性。抗體陽性者，色素內鏡發現早期癌和不典型增生人數占比大于陰性組，有統計學差異，結果見表4。

表4 自身抗體表達對比食管色素內鏡活檢病理結果 例(%)

2.5 大規模篩查結果在高發區使用血清學液體活檢技術共對16 212例無癥狀人群進行大規模篩查，受試者有至少一項自身抗體表達陽性時定義為高危人群。檢測出3 512例高危人群，其中有3 096例自愿接受色素內鏡檢查。接受色素內鏡檢查的受試者中，有1 053例(34.01%)為食管上皮不典型增生，393例(12.69%)為早期食管癌，30例(0.97%)中晚期食管癌，47例(1.52%)其他消化道腫瘤。

3 討論

食管癌很高的發病率和死亡率嚴重危害著人民群眾的健康，但是經過幾十年的研究，食管癌確切的發病機制并不清楚[14]，高發區食管癌的發病率和死亡率仍然居高不下。中晚期食管癌5 a生存率只有10%～20%，而早期食管癌的5 a生存率可高達95%，食管癌的早期發現及早期診斷就尤為重要。目前，色素胃鏡檢查是高發區無癥狀人群食管癌篩查最有效的方法[16]，但內鏡檢查程序復雜、費用昂貴以及對受檢者有創傷，同時還需要有經驗的內鏡醫師才能保證檢查結果的可靠性，這些原因造成高發區內鏡篩查不能大規模推廣。目前，急需一種新的食管癌篩查方法改善早期癌篩查現狀。

食管癌的發生發展是一個緩慢的多階段、多因素演進的過程，在腫瘤發展過程中，會產生腫瘤相關抗原，進而刺激機體產生針對這些抗原的自身抗體。自身抗體存在于患者的血液、細胞或組織中，可通過免疫學、分子生物學等方法測定其含量，對腫瘤的早期發現、早期診斷具有一定的價值。通過血清學檢查自身抗體，使得早期診斷腫瘤成為一種可能[14]。本研究分別檢測了腫瘤相關抗原自身抗體(STK15、P15和MLH1)在食管癌患者和正常人血清中的表達情況，結果表明該組自身抗體在兩組中表達差異明顯，各個指標在食管癌患者中陽性率均高于正常人。其中，食管癌患者血清P15自身抗體陽性率較正常人升高了14倍(29% VS 2%)，STK15和MLH1均較正常人升高了6倍(STK15∶38% VS 6%；MLH1∶37% VS 6%)。此外，3種自身抗體聯合檢測可以有效地區分食管癌患者和正常人群，敏感度和特異度分別為78%和 87%。表明該組自身抗體聯合檢測在食管癌篩查方面具有潛在的應用價值。

在食管癌高發區新鄉某地應用本研究發現的自身抗體組合對無癥狀人群進行血清學和色素內鏡篩查。在接受篩查的405例中，血清學自身抗體檢查陽性87例(21.48%)，陰性318例(78.52%)；進一步對405例行色素內鏡和黏膜活檢發現，自身抗體陽性組共檢出8例早期癌(9.20%)，29例不典型增生(33.33%)和49例正常上皮(56.32%)；自身抗體陰性組早期癌和不典型增生患者檢出率分別為2例(0.63%)和9例(2.83%)。兩組之間癌前病變與食管癌占比差異顯著，陽性組中檢出食管癌占檢出總食管癌的80%，表明該組自身抗體聯合檢測可以將無癥狀人群中80%的食管癌區分出來，具有較高的篩查價值。本研究6 a間應用自身抗體聯合檢測技術在食管癌高發區洛陽某地開展了應用性研究，共對16 212例無癥狀人群進行食管癌篩查，對血清學篩查陽性且自愿接受色素內鏡檢查的 3 096例行色素內鏡和黏膜活檢，共檢出393例早期食管癌(12.69%)、30例中晚期食管癌(0.97%)和1 053例不典型增生患者(34.01%)。本研究顯示自身抗體聯合檢測液體活檢技術結合色素內鏡檢查食管癌檢出率可達2.61%，與單純應用色素內鏡篩查檢出率相近。本研究顯著減少了胃鏡檢查人數，降低了篩查成本。

食管癌的發生發展是一個復雜多變的過程，由于腫瘤細胞之間的異質性，如腫瘤之間病理類型的差異、腫瘤細胞基因型及細胞表型之間的差異等導致食管癌癌變過程中會產生不同的腫瘤抗原，從而刺激機體產生不同的自身抗體[14]。本實驗室先前的研究報道了大量的在食管癌患者和正常人中表達差異明顯的自身抗體，為構建自身抗體食管癌篩查組合提供了分子基礎[4]。在不同的研究中分別報道了不同的自身抗體組合用于篩查食管癌癌前病變及早期食管癌患者[5，12，14]，與本研究相比，結果相似，但本研究發現的自身抗體組合應用抗體數目更少，應用更方便。本研究在無癥狀人群實際應用時，發現有一部分癌前病變患者和食管癌患者抗體表達陰性，提示本自身抗體組合還存在一定的局限性，還需要探索發現新的自身抗體，優化組合，提高檢測敏感度。

綜上所述，相對于單一指標，STK15、P15和MLH1血清自身抗體聯合液體活檢檢測可以提高無癥狀人群癌前病變和早期食管癌的檢出率，是食管癌高危人群篩查的有效方法。相較于傳統色素內鏡篩查早期食管癌，這一方法顯著減少了內鏡檢查對象，降低了篩查成本，可以作為食管癌高危人群預警和早期發現的重要手段，具有明顯的人群推廣應用價值。