Rb、MDM2和Bcl-2自身抗體聯(lián)合檢測在食管癌高發(fā)地區(qū)人群篩查中的應(yīng)用

趙學(xué)科，馬 磊，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，庫建偉，任書偉，張冬云，王立東

早期食管癌5 a生存率可高達(dá)90%[1]，然而早期食管癌患者無特異性臨床癥狀，導(dǎo)致臨床就診的食管癌患者中90%以上為中晚期，其5 a生存率僅為20%左右[2]，因此，食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)成為降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。內(nèi)鏡普查有成本高、創(chuàng)傷大、重復(fù)性檢查、患者依從性低且需要經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師等不足，很難在高發(fā)區(qū)大規(guī)模無癥狀人群篩查中推廣應(yīng)用。

液體活檢是近年興起的一種無創(chuàng)、高效的腫瘤篩查技術(shù)[3-4]，主要包括腫瘤相關(guān)抗原和蛋白檢測、高易感基因及其蛋白產(chǎn)物檢測、游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)[5]檢測、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)檢測等[6-7]。食管癌變是一個(gè)多階段演進(jìn)過程，早期病變以食管上皮細(xì)胞過度增生為特征，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為基底細(xì)胞過度增生(basal cell hyperplasia, BCH)、不典型增生(dysplasia,DYS)和原位癌。近年研究提示，食管癌前病變形態(tài)改變之前已發(fā)生多種基因和蛋白的變化[8]，包括來自腫瘤細(xì)胞的一組特異蛋白，后者可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)(自身抗體)，這一組蛋白被稱為腫瘤相關(guān)抗原(tumour-associated antigens,TAAs)。因此，無癥狀人群血清腫瘤相關(guān)自身抗體檢測作為一種重要的檢測指示，有助于食管癌高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)。本研究旨在對發(fā)現(xiàn)的食管癌相關(guān)抗原自身抗體進(jìn)行組合、優(yōu)化，在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行多中心無癥狀人群普查，以實(shí)現(xiàn)食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)，降低人群篩查成本，提高食管癌患者生存期。

1 材料與方法

1.1 研究對象第一組實(shí)驗(yàn)組人群來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室收集的食管癌患者的血清標(biāo)本215例，患者經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為食管癌，采樣前均未接受放療和化療治療。其中男109例，女106例；年齡 37～70(59±7.3)歲。對照組為來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，其性別和年齡與實(shí)驗(yàn)組相匹配。第二組人群為食管癌高發(fā)區(qū)河南省新鄉(xiāng)市輝縣市鄭屯村自愿接受流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查的35歲以上無癥狀居民589例，其中男299例，女290例；年齡35～70(51±8.5)歲。第三組為2010年至2019年食管癌高發(fā)區(qū)河南南陽、信陽地區(qū)的19 986例35歲以上無癥狀人群，行液體活檢，并對高危人群行色素內(nèi)鏡、病理活檢檢查。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血樣采集研究對象填寫基本信息調(diào)查表，并收集空腹靜脈血5 mL，之后將其置于離心管內(nèi)，在室溫下靜置30 min后以2 000 r·min-1，離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，-80 ℃保存。

1.2.2 血清自身抗體測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg·μL-1，血樣稀釋濃度為1∶50，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為1∶5 000。向酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原，每孔100 μL，4 ℃過夜(24 h以上)。加入稀釋后的病人血清，每孔100 μL，每個(gè)樣品至少做2次檢測，37 ℃孵育1 h。已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。加入TMB過氧化脲顯色液，每孔100 μL，置37 ℃避光反應(yīng)10 min，當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，并在ELISA檢測儀上讀取A450吸光度值。

1.2.3 血清檢測結(jié)果判定采用Scripps研究所判定方法，即以正常血清A450讀數(shù)的均數(shù)±3標(biāo)準(zhǔn)差為Cut-off值(截?cái)嘀?，讀數(shù)在此值以上的為陽性，否則為陰性。有一項(xiàng)自身抗體表達(dá)陽性時(shí)，該受試者即定義為食管癌高危人群。

1.2.4 蛋白芯片分析針對19 986例35歲以上無癥狀人群，采用人蛋白質(zhì)組定制芯片V3.0(CDI Laboratories)檢測。每個(gè)芯片上包含Rb、MDM2、Bcl-2純化蛋白質(zhì)微陣列。每張蛋白芯片可同時(shí)檢測96例人體血清。從-80 ℃取出微陣列，在阻斷緩沖液(3%BSA在PBS)中室溫孵育3 h。然后將血清樣本以1∶2 000的比例在結(jié)合緩沖液(1%)中稀釋，將BSA(PBST)加入微陣列中孵育，4 ℃過夜。PBST洗滌后，微陣列與1∶1 000稀釋熒光標(biāo)記山羊抗人IgG(532 nm)在室溫避光反應(yīng)1 h。PBST洗滌后，對微陣列用ddH2O沖洗并干燥。用GenePix Pro6.0(Axon儀器，加拿大)提取每個(gè)免疫熒光點(diǎn)的強(qiáng)度，判斷抗原抗體免疫反應(yīng)[9]。

1.2.5 色素內(nèi)鏡檢查常規(guī)行食管黏膜碘染色，在食管黏膜不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于85%乙醇內(nèi)固定。

1.2.6 病理組織學(xué)檢查對胃鏡獲取的活檢組織常規(guī)處理后，每張切片厚3 μm，HE染色，作組織病理學(xué)診斷。

2. 結(jié)果

2.1 3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌和對照組血清中的檢測情況見表1。Rb、MDM2和Bcl-2這3種腫瘤抗原自身抗體在食管癌患者和正常對照人群血清中的陽性檢出率(靈敏度)分別為35.81%、32.09%和45.58%，特異度分別為93.49%、94.88%和92.09%；Rb+ MDM2、MDM2+ Bcl-2和Rb+ Bcl-2兩種腫瘤抗原自身抗體聯(lián)合檢測，在食管癌患者和正常人群血清中陽性(至少一個(gè)指標(biāo)陽性)檢出率(靈敏度)分別為51.16%、61.86%和67.44%，特異度分別為92.56%、91.63%和90.23%。Rb、MDM2和Bcl-2這3種腫瘤抗原自身抗體聯(lián)合檢測，在食管癌患者和正常對照人群血清中陽性(至少一個(gè)指標(biāo)陽性)檢出率(靈敏度)高達(dá)84.65%，特異度為82.33%。

表1 3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌和健康對照組人群血清中檢測結(jié)果自身抗體

2.2 3種自身抗體聯(lián)合檢測食管癌高發(fā)區(qū)589例無癥狀人群篩查見表2。589例無癥狀人群血清中3種腫瘤抗原自身抗體(至少一個(gè)指標(biāo))陽性檢出率為20.90%，共檢出125例食管癌高危人群和473例非高危人群；對589例無癥狀人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡和黏膜活檢病理檢查，125例食管癌高危人群中共確診13例(10.40%)早期食管癌、30例(24.00%)各級癌前病變患者；464例非高危人群中確診2例早期食管癌和6例癌前病變患者，3種自身抗體血清陽性人群(高危人群)中早期食管癌和癌前病變患者檢查率明顯高于陰性組人群，P<0.001，其靈敏度高達(dá)84.65%。

表2 3種自身抗體聯(lián)合檢測及色素內(nèi)鏡、病理活檢對589無癥狀人群高危人群篩查結(jié)果對比

2.3 高發(fā)區(qū)19 986無癥狀人群高危人群篩查使用3種自身抗體聯(lián)合檢測19 986例無癥狀人群，共檢測到至少一項(xiàng)自身抗體陽性的高危人群3 624例，其中早期食管癌373例(1.87%)，各級癌前病變1 352例(6.76%)，中晚期食管癌21例(0.11%)，其他上消化道腫瘤36例(1.80%)。該組人群早期食管癌及癌前病變患者色素內(nèi)鏡及病理活檢檢出率與589例無癥狀人群的檢出率相近。

3 討論

腫瘤細(xì)胞生物學(xué)具有復(fù)雜多態(tài)的特性，同種腫瘤病理類型的差異、同種病理類型腫瘤的異質(zhì)性等原因都造成了癌變過程中產(chǎn)生不同的抗原，通過多個(gè)腫瘤相關(guān)抗原聯(lián)合檢測自身抗體有助于提高食管癌的檢出率[10-11]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證明食管癌相關(guān)抗原Rb、MDM2、Bcl-2存在明確的自身抗體[12]，本研究檢測了3種食管癌相關(guān)抗原自身抗體的不同聯(lián)合檢測方法在食管癌高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)中的差異。單個(gè)自身抗體陽性時(shí)，發(fā)生食管癌變的風(fēng)險(xiǎn)是自身抗體陰性人群的7倍多，其靈敏度只有32.09%，而當(dāng)3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測時(shí)，只要其中一個(gè)指標(biāo)陽性，就確定為食管癌高危人群，而此時(shí)高危人群發(fā)生食管癌的風(fēng)險(xiǎn)較陰性組高出25倍多，且敏感性和特異性高達(dá)84.65%和82.33%，從而證實(shí)多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測判斷食管癌高危人群風(fēng)險(xiǎn)的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單個(gè)指標(biāo)的檢測。

本研究對589例無癥狀人群進(jìn)行食管癌相關(guān)抗原Rb、MDM2、Bcl-2這3種自身抗體液體活檢，并篩選出高危人群，然后對所有無癥狀人群進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查，并取食管黏膜上皮做病理學(xué)檢測和診斷，兩種方法比較后發(fā)現(xiàn)：液體活檢方法確定的高危人群中早期食管癌和各級癌前病變占所有早期食管癌和各級癌前病變患者的84.31%，用色素內(nèi)鏡和病理活檢確診的方法再次證明了本研究利用Rb、MDM2、Bcl-2這3種食管癌自身抗體作為液體活檢指標(biāo)對預(yù)測食管癌高危人群的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，用食管癌高發(fā)區(qū)19 986例無癥狀人群進(jìn)行大規(guī)模驗(yàn)證，也再次證實(shí)了以上結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，利用Rb、MDM2、Bcl-2這3種食管癌自身抗體作為液體活檢技術(shù)篩選出的食管癌高危人群占全部無癥狀人群的20%左右，可減少80%的無癥狀人群胃鏡篩查，大大節(jié)約了醫(yī)療資源，減少了大量不必要的陪伴檢查和重復(fù)檢查，受檢者也更容易接受。

然而，該組指標(biāo)陽性的高危人群中，仍有一半左右的無病變?nèi)巳海貎?nèi)鏡和活檢病理檢查均無異常，并且在指標(biāo)檢測為陰性的無癥狀人群中，仍有一小部分人最終發(fā)展為食管癌。在一定程度上，顯露出本組液體活檢分子在食管癌高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)中出現(xiàn)的假陽性和假陰性，仍需對液體活檢分子指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化、組合，比如食管癌相關(guān)的基因、蛋白、自身抗體、miRNA、甲基化等分子指標(biāo)。

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段演進(jìn)的過程，是多種基因參與的復(fù)雜性疾病，在腫瘤發(fā)展過程中，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生針對這種腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體，是目前研究進(jìn)展最為迅速的一種腫瘤標(biāo)志物。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有良好的特異性、較高的敏感度，能夠明確地區(qū)分腫瘤患者和非腫瘤患者。自身抗體存在于患者的血液、細(xì)胞或組織中，可通過免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方法測定其含量，對腫瘤的早期診斷、早期發(fā)現(xiàn)具有一定的價(jià)值。通過血清學(xué)檢查自身抗體，使得早期診斷腫瘤成為一種可能。