TGF-β1/Smad信號通路在人參養榮湯抑制AngⅡ誘導心肌細胞肥大中的作用研究

譚健鋒 溫 威 黃華聰△ 高卓維,2*

（1 南方醫科大學順德醫院，廣東 佛山 528308；2 廣州中醫藥大學順德醫院，廣東 佛山 528300）

心臟通過一系列反應來響應環境刺激，包括腔室容積，收縮壓收縮，舒張期舒張，心率和肌肉質量的變化。生理性肥大通常發生在對健康運動或懷孕的正常反應期間[1]。病理性肥大通常由壓力刺激或由疾病引起，如高血壓，心臟瓣膜病，心肌梗死和神經激素。病理性心臟肥大通過在早期階段增加心臟超負荷起到補償作用。然而，持續的病理性肥厚反應最終導致收縮功能障礙和心力衰竭[2]。病理性心臟肥大最要由心肌細胞適應不良性肥大、心肌細胞凋亡和心肌細胞外基質纖維化[3]。作為治療選擇，抑制病理性心肌細胞肥大已成為許多心血管疾病潛在的治療靶點[4]。TGF-β1/Smad信號通路在心臟重構以及心力衰竭的發生發展機制中發揮了重要作用，參與了包括心肌細胞肥大，心肌細胞凋亡和心肌纖維化等進程，并調節壓力超負荷心臟中的基質代謝[5]。由于其在心臟重構中的關鍵作用，TGF-β信號通路可能是心力衰竭患者新的治療靶點[6]。人參養榮湯出自于《太平惠明和劑局方》，是益氣補血的代表方，被廣泛地應用于心血管疾病的防治當中[7]。但其作用機制仍未明確，本研究對人參養榮湯抗血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌細胞肥大作用進行探討，并明確TGF-β1/Smad信號通路在人參養榮湯抑制心肌細胞病理性肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級Wistar大鼠購買自南方醫科大學實驗動物中心（動物許可證號：SCXK粵4402102064）。于南方醫科大學SPF級動物房飼養，提供清潔的飼料、飲用水以及晝夜各 12 h的規律光照。動物實驗通過南方醫科大學動物福利與倫理委員會審查。

1.2 實驗藥物：實驗所用中藥黃芪、當歸、桂枝、炙甘草、陳皮、白術、人參、白芍、熟地黃、五味子、茯苓、遠志、大棗均購買自致信藥業或康美藥業。TGF-β1、Smad2，Smad3和 GAPDH的抗體購自美國CST公司。BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶與磷酸酶抑制劑、RIPA細胞裂解液購買自碧云天生物科技有限公司。PVDF膜、ECL發光液購買自Millipore公司。MTT購買自美國SIGMA公司。

1.3 實驗器材：BIO-RAD電泳儀、蛋白轉印系統購買自美國伯樂太平洋有限公司，曝光機為KODAK 全光譜多功能活體成像系統、酶標儀購買自美國SIGMA公司，電子天平購買自梅特勒一托利多儀器有限公司，MICROMAX高速離心機購買自賽默飛世爾科技公司。

1.4 細胞培養：H9C2細胞系購自中國科學院細胞庫（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。H9C2細胞在使用含有10%FBS（美國Gibco公司）的DMEM中培養（美國Gibco公司）并置于37 ℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。實驗前，H9C2采用無血清的DMEM培養24 h，隨后根據不同的實驗分組加入AngⅡ和含藥血清。

1.5 含藥血清制備：SD大鼠適應性喂養7 d，讓后隨機為空白對照組和人參養榮湯給藥組，每組12只。人參養榮湯給藥組按大鼠與人體積等效劑量系數折算給藥（劑量為7.5 g/kg）；空白對照組給與等體積理鹽水進行灌胃，連續灌胃3 d，每天2次；第4天清晨給藥1 h后腹主動脈取血，室溫靜置30 min后離心（1500 rpm，10 min），取上層血清并置于56 ℃恒溫水浴鍋中滅活30 min，并用0.22 μm濾器過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.6 MTT檢測細胞活力：通過MTT法檢測AngⅡ和人參養榮湯含藥血清對H9C2心肌細胞活力的影響。將收集的細胞按（5×103/mL）加入在96孔板中，并加入不同濃度的AngⅡ和人參養榮湯含藥血清培養24 h。然后棄培養基，加入10 μL MTT溶液（0.5 mg/mL，PBS溶解）到每個孔中。在37 ℃孵育4 h后，棄MTT加入200 μL DMSO，避光孵育10 min后通過酶標儀在490 nm波長測量OD值。

1.7 qPCR檢測心肌細胞中ANF、α-SMA、GAPDH mRNA表達水平。實驗分組：空白組、模型組（AngⅡ）、人參養榮湯低濃度組（AngⅡ+10%人參養榮湯含藥血清）、人參養榮湯高濃度組（AngⅡ+15%人參養榮湯含藥血清）。細胞經上述處理24 h后，用TRIzol提取各組細胞的總RNA并逆轉錄成cDNA（1～2 μg），用于各個基因的特異性引物（表1）進行PCR擴增。使用相對定量方法比較轉錄物量，其中將檢測到的mRNA的量標準化為內源對照（GAPDH）。

表1 ANF、α-SMA、GAPDH引物堿基序列

1.8 Western blot 檢測心肌細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3信號通路表達水平。實驗分組：空白組、模型組（AngⅡ）、人參養榮湯低濃度組（AngⅡ+10%人參養榮湯含藥血清）、人參養榮湯高濃度組（AngⅡ+15%人參養榮湯含藥血清）。收集經過不同處理的心肌細胞，計入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液提取培養細胞的蛋白質。裂解30 min后12000 rpm，4 ℃下離心15 min，取蛋白上清液。在10%SDS-PAGE凝膠上分離大約20 mg蛋白質，并轉移到PVDF膜上，接著用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。然后把切割好的膜分別與相應的一抗在4 ℃溫育過夜（TGF-β1、Smad2、Smad3、GAPDH，稀釋濃度1∶1000）。一抗孵育結束后用含有TBST洗滌三遍，并于4 ℃下孵育二抗2 h。通過ECL化學發光液曝光得到蛋白條帶，并使用ImageJ軟件分析條帶蛋白濃度。

1.9 數據分析：數據分析結果采用均數±標準差。采用SPSS19.0軟件進行數據分析。如數據滿足方差齊性，所有指標多組間比較分析均采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），如不滿足方差齊性，組間多重比較則采用Dunn's檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參養榮湯對AngⅡ誘導的H9C2心肌細胞活力的影響：MTT結果顯示，與空白組相比較，人參養榮湯在5%～20%含藥血清濃度范圍內并未明顯促進H9C2心肌細胞活力（圖1-A）。我們分別選擇10%和15%含藥血清作為人參養榮湯低、高濃度組進行后續實驗。根據圖1-B結果顯示，AngⅡ模型組能夠顯著促進H9C2心肌細胞活力。人參養榮湯低、高劑量組能夠顯著抑制AngⅡ誘導的增高心肌細胞活力，結果具有統計學意義（P<0.05）并成濃度依賴性。結果提示AngⅡ能夠誘導心肌細胞肥大，促進細胞活力異常增高，人參養榮湯能夠抑制AngⅡ誘導的心肌細胞病理性肥大。結果見圖1。

圖1 H9C2心肌細胞活力

2.2 各組心肌細胞中ANF、α-SMA mRNA表達水平：與空白組相比較，AngⅡ模型組顯著促進心肌細胞中ANF、α-SMA mRNA的表達。人參養榮湯低、高劑量組能夠AngⅡ誘導的ANF、α-SMA mRNA的表達，并呈濃度依賴性。見表2。

表2 心肌細胞中ANF、α-SMA mRNA表達水平（±s）

表2 心肌細胞中ANF、α-SMA mRNA表達水平（±s）

注：與模型組相比較，*P<0.05

2.3 各組心肌細胞中TGF-β1/Smad信號通路表達水平：與空白組相比較，AngⅡ處理H9C2心肌細胞24 h后顯著促進TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白水平。與AngⅡ模型組相比較，人參養榮湯低、高劑量組顯著抑制TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達水平，結果具有統計學意義（P<0.05）。提示人參養榮湯能夠抑制心肌細胞中TGF-β1/Smad信號通路的表達水平。見圖2。

圖2 心肌細胞中TGF-β1/Smad信號通路水平

3 討 論

心臟肥大被認為是心血管疾病發病率和病死率的獨立危險因素[8]。即使一些心腦血管藥物如今可以治療由心臟肥大引起的心力衰竭，但其病死率仍然很高[9]。因此，尋找防治心臟肥大和心力衰竭的新藥物具有重要的臨床意義。在細胞水平上，病理性心臟肥大的典型特征是增加的心肌細胞大小，肌節結構的分離，增強的蛋白質合成以及胎兒基因重新表達（ANF和α-SMA）[10]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）的過度激活在啟動心室重構，以及由重構發展到心衰的過程中起關鍵作用[11]。針對這兩個系統開發的藥物如：血管緊張素轉換酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（Angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB）等防治心室重構和心力衰竭的療效已被大量循證醫學研究證實，并寫入治療指南[12]。血管緊張素Ⅱ （AngⅡ）通過AT1依賴性相互作用促進心肌細胞肥大并刺激成纖維細胞增殖和細胞外基質蛋白的表達[13]。AngⅡ是誘發心肌肥厚的主要因素之一，可導致心臟肥大并加重心力衰竭[14]。大量證據表明RAS系統與TGF-β之間存在直接聯系，表明TGF-β1作用于血管緊張素Ⅱ的下游[15-17]。血管緊張素Ⅱ刺激誘導心肌細胞和心臟成纖維細胞TGF-β1mRNA和蛋白表達[18]。ACE抑制劑或AT1受體阻滯劑治療顯著降低肥大和梗死心臟中的TGF-β1水平，提示重塑心肌中TGF-β1的誘導至少部分是通過血管緊張素Ⅱ介導的[19]。研究表明，使用TGF-β1抑制劑通過調節TGF-β1/Smad信號通路的表達與活化，顯著抑制Ang Ⅱ輸注小鼠的心臟肥大，纖維化和功能障礙[20]。本研究發現Ang Ⅱ作用與H9C2心肌細胞24 h后，可增加心肌細胞活性，促進心肌細胞病理性肥大，增加心肌細胞內ANF和α-SMA mRNA和TGF-β1/Smad信號通路的表達水平，與既往研究結果相一致。

心肌肥大作為一個從心梗到心衰之間的病理過程，在中醫古籍中并無具體的病名或病因病機的記載。但根據其臨床表現，正氣不足乃其內傷基礎，貫穿于發病的整個過程[21]。因此治療上當以益氣補血為治療原則。臨床上采用益氣補血法防治心血管疾病常取得較好療效[22-23]。人參養榮湯出自宋代的《太平惠民和劑局方》，是益氣養血法的代表方，方中用人參、黃芪，陳皮、白術、茯苓健脾益氣，補元氣使氣旺血行，周流全身；熟地黃、白芍、當歸養血行血；遠志、五味子養心安神；桂心補陽活血。諸藥相合，補氣養血，共奏補虛養心之功。林慧娟[24]等采用人參養榮湯治療心肌缺血，能夠改善活動后胸悶，心慌。趙洪運[25]等使用人參養榮湯治療急性病毒性心肌炎，發現與常規治療相比，加用人參養榮湯能夠更快地促進癥狀消失，心電圖、心肌酶譜恢復正常。現代藥理血研究表明，方中諸藥的多種有效成分具有防治心血管病作用[26-28]。人參中的有效成分人參皂苷Rd能夠通過抑制小鼠心肌內AKT、TGF-β1的表達水平，顯著改善了壓力超負荷引起的小鼠收縮功能障礙，纖維化，心肌肥厚，炎癥和氧化應激，同時抑制由苯腎上腺素誘導的體外心肌細胞肥大，從而改善心室重構和心力衰竭[29]。另外，有研究報道黃芪中的主要成分黃芪甲苷（ASIV）聯合電針干預對異丙腎上腺素（ISO）誘導的心肌肥厚大鼠，能夠顯著改善大鼠心肌肥厚以及抑制TGF-β1/Smad信號通路的激活[30]。本研究對人參養榮湯抑制心肌細胞病理性肥大作用進行觀察，發現人參養榮湯能夠顯著抑制由AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，降低心肌細胞內ANF、BNF的mRNA水平，同時抑制心肌細胞內TGF-β1/Smad信號通路的表達。

本研究發現人參養榮湯可能通過抑制心肌細胞內TGF-β1/Smad信號通路的表達發揮抑制心肌細胞病理性肥大，未人參養榮湯防治心臟肥大，改善心室重構提供物質基礎和治療靶點。本研究僅基于細胞水平進行，后續仍需通過動物實驗和臨床觀察進行一步探討。