多發性骨髓瘤循環miRNAs的研究進展及應用

魏曉晶，邱錄貴，郝 牧

多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）[1-2]是一種多發于中老年人群的單克隆漿細胞惡性增殖性疾病。臨床表現變化大,從無癥狀到腫瘤細胞具有侵襲性,其臨床表現是由于異常的免疫球蛋白沉積所致，包括高鈣血癥、腎功能不全、貧血和骨病(CRAB 癥狀)[3]。幾乎所有MM[4]都是從相對良性的意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance,MGUS)發展而來。在過去的10 年中，由于新藥的廣泛使用[5]，如蛋白酶體抑制劑（硼替佐米）、免疫調節藥物（來那度胺）、單克隆抗體和組蛋白乙酰化酶抑制劑等，極大地提高了MM 患者療效并改善患者生存。目前，骨髓瘤仍然不能治愈，幾乎所有患者均會復發、難治、甚至不治。在MM 發生發展以及治療過程中，精準的預后分層、及時準確的療效評估對臨床診治有著重要意義。

1 循環miRNA的來源及存在形式

1.1 miRNA定義及功能MiRNAs是一類18-24 個核苷酸的內源性單鏈非編碼小RNA。MiRNA 通過與靶mRNA 的3′非編碼區(3′-UTR)結合，抑制靶mRNA 翻譯和基因表達[6]，發揮內源性RNA 干擾作用，在轉錄后水平負調控靶基因表達。MiRNAs 表達具有高度的組織特異性，調控人類約60%的基因表達，廣泛參與生理發育及疾病發生，在細胞增殖、分化、凋亡及代謝等方面均發揮重要作用[7]，并可作為致癌或抑癌基因參與腫瘤的發生發展。隨著檢測技術的進步，特別是高通量測序技術的應用，miRNA在各種腫瘤細胞的表達譜相繼被報道。

1.2 循環miRNA 的來源 作為循環核酸的一種，循環miRNA 可穩定存在于外周血中。近些年，循環血液中miRNA 表達與腫瘤相關性的研究越來越多。這些循環miRNA 隨循環系統到達機體的各個部位，是腫瘤發展、遷移的重要途徑。基于外周血清、血漿檢測具有創傷小、穩定性好、可短期反復多次檢測等優點，外周血循環miRNA 成為理想的腫瘤標志物。循環miRNA 的來源主要有三種：①破裂的細胞或受損的組織被動釋放；②經由外泌體主動分泌；③不被外泌體包裹，與RNA 結合蛋白結合被分泌。外周血中miRNA與腫瘤細胞內miRNA表達圖譜并不完全匹配，腫瘤微環境中其他細胞，如基質細胞等也可分泌miRNA 進入血液循環，研究顯示細胞釋放miRNA 具有選擇性。微環境對腫瘤細胞miRNA 釋放有調控作用，但是其具體分子機制目前尚不清楚。

2 循環miRNA在MM診斷中的應用

2.1 MM患者血清游離miRNAs 基于外周血清、血漿檢測具有創傷小、穩定性好、可短期反復多次檢測等優點，外周血循環miRNA 成為理想的腫瘤標志物。目前公認的用于液體活檢的小分子為循環腫瘤DNA、miRNAs、外泌體、循環游離DNA 等。越來越多的研究表明循環miRNAs 表達異常可作為MM 的診斷標志物。Jones 等[8]對MGUS 患者（n=15）、初診MM 患者（NDMM，n=24）以及健康人（Healthy Donor，HDn=13）和非MM 患者（n=20）的血清RNA 進行small RNA 測序，篩選到三個與MM發生密切相關的miRNAs 分子：miR-720、miR-1308和miR-1246。研究顯示高表達的miR-720 和低表達的miR-1308 可作為MM 和MGUS 的診斷標志物（AUC=0.9862）。MiR-1246 的高表達與miR-1308的低表達可以輔助鑒別MGUS 與MM（AUC=0.7250）。Qu 等[9]對9例NDMM 和7例HD 的血清標本進行測序，篩選出12 個差異miRNAs，對其中10個有顯著差異的miRNAs進行擴大樣本（NDMMn=40、HDn=20）的qPCR 驗證，結果顯示miR-483-5p在MM 患者血清中表達水平顯著高于HD(AUC=0.745)。同時有研究發現，miR-202在MM 患者血清中高表達[10]，AUC 為0.711，敏感性和特異性分別為80.0%和60.0%。MiR-202 與MM 患者血清中的β2微球蛋白和κ 輕鏈的濃度呈正相關(r=0.366,P=0.0305；r=0.358,P=0.0348)。MiR-203[11]的表達在血液中始終與β2 微球蛋白、M 蛋白和球蛋白密切相關，非侵入性檢測miR-203 的表達水平具有良好的診斷意義。Kubiczkova 等[12]發現與HD 相比，MGUS、NDMM 和復發多發性骨髓瘤(Relapsed Multiple Myeloma，RMM）中miR-744、miR-130a、miR-34a、let-7d 和let-7e 異常表達。多因素logistic回歸分析顯示，miR-34a 和let-7e 聯合檢測可鑒別MM與HD（敏感性為80.6%，特異性為86.7%），同時也可區分MGUS 與HD（敏感性為91.1%，特異性為96.7%）。此外，低水平的miR-744 和let-7e 與MM較短的總生存(Overall Survival,OS)和緩解期有關。我們團隊也長期致力于MM 中miRNA 參與的疾病發生發展的機制[13]、新型miRNA 藥物[14]及血清分子標志物的研究[15]，對7例NDMM 患者和5例HD的血清miRNA 進行基因芯片分析，通過擴大樣本量（NDMMn=108，HDn=56）的qPCR 驗證，發現miR-19a 和miR-4254 在MM 患者血清中表達明顯降低。ROC 曲線分析顯示miR-19a 聯合miR-4254可用于MM 的診斷(其敏感性為91.7%，特異性為90.5%)。生存分析顯示，血清miR-19a 的低表達與MM 患者較短的無進展生存和總生存密切相關，是MM患者獨立的預后不良因素。骨病是MM常見的臨床癥狀，多數患者以骨痛為首發癥狀，骨病嚴重程度影響患者生存質量和生存時間。循環miRNAs表達水平在一定程度上可以反應骨病的等級。Hao 等[16]發現血清miR-214 和miR-135 高表達與溶骨性病變的嚴重程度呈正相關，可作為MM 骨病的診斷工具。上述研究結果表明MM 患者血清循環miRNA 的表達譜與正常人存在明顯差異，可作為MM診斷的生物標志物。

2.2 MM血清外泌體 外泌體是一種直徑30～150 nm的包裹有遺傳物質（DNA 和RNA）及蛋白質的磷脂雙分子層囊泡。外泌體作為信息傳遞的載體，最終會將其攜帶的遺傳物質釋放到受體細胞中發揮其功能[17]。隨著大型儀器的發展和應用，研究者們對外泌體有了更多新的認識和研究。由包括癌細胞在內的多種細胞類型分泌的外泌體可從外周血中分離出來，并已被證明是癌癥疾病進展的有力標志物[18]。Manier[19]最先在156 例MM 患者中進行血清外泌體miRNAs 生物標志物的研究，結果表明，MM患者血清外泌體中miRNA 表達譜與正常人存在22個差異表達的miRNAs，其中兩個miRNAs（let-7b 和miR-18a）與MM 的無進展生存(Progress Free Sur‐vival,PFS)和OS 顯著相關，低表達let-7b 與miR-18a的MM 患者有較短的無進展生存期和總生存時間。外泌體來源的miRNAs[20]表達模式也可預測MM 患者對硼替佐米的耐藥性。與對硼替佐米敏感的MM 患者相比，外泌體內miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-20a-5p 和miR-17-5p 表達下調出現在對硼替佐米耐藥患者血清中。血清[21]外泌體的miR-20a-5p、miR-103a-3p和miR-4505在MM、SMM和HD的血清中顯著差異表達，而MM 患者血清中低表達let-7c-5p、miR-185-5p，高表達miR-4741（與SMM 患者或HD 相比）。漿細胞來源的外泌體miRNAs 輔助漿細胞的增殖。由于骨髓內惡性腫瘤細胞的快速增殖會導致骨髓產生缺氧的環境，耐缺氧的MM 細胞會產生更多的外泌體，外泌體miR-135b 也顯著上調[22]。MiR-135b 直接抑制其靶因子缺氧誘導因子抑制因子（Factor-Iinhibiting Hypoxia Inducible Fac‐tor 1，FIH-1），通過HIF-FIH 信號通路在缺氧的條件下促進內皮血管的生成，從而為腫瘤細胞的增殖生存提供有利的環境。MM 患者血清差異miRNAs與血清外泌體差異miRNAs 的表達水平并不一致[23]且沒有相關性。腫瘤漿細胞來源的外泌體[24]還參與到對MM 患者骨質的破壞過程并抑制成骨細胞的生成，因此，外泌體是一個亟待開發的囊泡，外泌體參與的疾病發生機制及功能需要更多的研究者探索。

3 循環miRNA 在MM 療效評價、預后評估中的研究進展及應用

幾乎所有MM患者均會復發、進展，在MM治療過程中，精準的預后分層、及時準確的療效評估對臨床診治有重要意義。循環miRNAs的表達水平一定程度上提示MM 患者的生存時間和預后。Roc‐ci[25]對54 例NDMM 血清miRNAs 測序后篩選出25個在20% MM 患者中可檢測到的miRNAs，其中10個miRNAs 在234 例NDMM 血 清miRNAs 的qPCR實驗中被證實有差異表達。血清低表達miR-25[25]提示患者有較短的PFS 和OS，低表達miR-16 則與MM 患者較短的OS 密切相關。對于符合移植條件的MM 患者，在經化療藥物治療后應進行造血干細胞移植，減少MM 復發機率。有研究者對MM 患者初診、完全緩解（Complete Remission，CR）時的血清miRNA 進行測序并通過qPCR 驗證發現miR-16、miR-17、miR-19b、miR-20a 和miR-660 在患者初診及經自體造血干細胞移植后CR 時差異表達，miR-19b 和miR-331 表達降低的患者[26]PFS 明顯縮短(HR=5.3，P=0.033)。在移植后復發的患者血清中，miR-19b 表達水平進一步降低，表明循環miR-19b的表達水平可作為MM 治療前，CR 時以及自體造血干細胞移植后復發的動態監測生物標志物，是理想的非侵入性檢測指標之一。Park 等[27]研究結果顯示，在早期復發患者循環血中，從診斷到自體移植前，miR-193a-5p 表達呈逐漸下降趨勢，自體移植前ISS 分期和miR-193a-5p 的表達情況是獨立預后因素，因此，循環miR-193a-5p可以作為是否適合移植的預后生物標志物。

MM 患者漿細胞中出現不同的遺傳學異常也影響患者的預后。最常見的TP53 缺失是MM 患者的高危遺傳學異常之一，患者OS 時間較短。遺傳學異常往往伴有miRNAs 異常轉錄表達。Huang等[28]對12 例NDMM 以及8 例HD 進行測序篩選出6個差異表達的miRNAs：miR-148a、miR-181a、miR-20a、miR-221、miR-625 和miR-99b。隨后在28 例HD 及12 例NDMM 患者中進行驗證發現，miR-99b的高表達與t (4，14)染色體異位相關（P=0.029），而miR-221 的低表達與del(13q)相關（P=0.04），此外高表達的miR-20a 和miR-148a 與較短的無進展生存期相關。MiRNAs 參與調控MM 細胞對藥物的敏感性[29]。Jung 等[30]對38 例接受來那度胺治療后復發MM 患者外周血循環miRNA 表達譜進行了miRNA 芯片分析。結果顯示miR-26a-5p、miR-29c-3p、miR-30b-5p、miR-30c-5p、miR-193a-5p 和miR-331-3p 在來那度胺治療中從未獲得緩解的RRMM患者較獲得緩解之后復發的患者表達降低，這部分患者生存時間明顯縮短。因此，這些miRNAs 可預測來那度胺和小劑量地塞米松對RRMM 的療效。基于miRNAs的結果建立來那度胺聯合地塞米松治療反應預測模型[30]，該模型使用了兩個miRNAs(miR-26a-5p 和miR-193a-5p)和5 個臨床變量(細胞遺傳學、ISS分期、血紅蛋白、WBC和鈣的濃度)組成的輸入特征，在ROC 模型中AUC 為0.933，MM 患者可以根據這個模型較早的明確對來那度胺聯合地塞米松的治療反應情況。循環miRNAs可作為預測RRMM 患者治療反應和預后的微創標記物。基于外周血的易獲得性，循環miRNAs 可取代傳統骨髓活檢的侵入性腫瘤細胞檢查。

4 循環miRNA應用于MM臨床診斷的前景

近年來循環生物標志物研究取得了快速的進展，FDA 已批準多項循環腫瘤DNA 用于臨床檢查[31]。循環miRNA 檢測代表腫瘤液體活檢最前沿的無創檢測技術，研發循環miRNA作為MM早期診斷、療效和預后評估以及微小殘留病的生物標記物具有較好的應用前景，但是在進入臨床應用之前還需解決循環miRNA 檢測技術的標準化。雖然miRNA 穩定存在于循環血清中，但目前尚無公認的miRNA 定量實驗內參。與其他新興技術的臨床轉化一樣，循環miRNA 檢測、分析方法和技術必須進行標準化。隨著對循環miRNA 特異性、準確性和規范化檢測方法等全面系統研究，循環miRNA有望成為MM 早期診斷、預后評估、微小殘留病檢測的小分子生物標志物。