電針對佐劑性關節炎大鼠踝關節滑膜細胞胞漿內IκB 磷酸化的影響

祁 芳，李艷玲，艾 坤*，蔡 雄，李 鑫，劉 梨，楊茜蕓

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208，2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因不明、發病率高、致殘率高的慢性自身免疫性疾病[1]，治療棘手。中醫針灸治療RA 歷史悠久、療效甚佳，因此，RA 的疾病發展機制以及針灸治療RA的干預機制持續成為了醫學界的研究熱點。 現有的研究證實，人體內核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 炎性通路的激活在RA 的發生發展中有著至關重要的作用[2]。 本實驗以NF-κB 信號通路為切入點，通過電針佐劑性關節炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠模型，在證實電針抗炎作用的基礎上，通過檢測大鼠踝關節滑膜細胞胞漿內NF-κB 信號通路上游的前信號因子IκB 的磷酸化水平，進一步揭示電針可能的抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

由湖南中醫藥大學實驗中心提供的SPF 級雄性SD 大鼠70 只，體質量（100±15） g，動物許可證號：SYXK(湘)2013-0005，在條件適宜的SPF 級實驗室喂養1 周后，用電子秤測量每只大鼠體質量，根據測量結果進行體質量的分層(10 g 一分層)，挑選體質量為（130±15） g 的大鼠納入實驗，體質量偏輕或偏重者剔除，最終保留60 只體質量均勻的大鼠，然后將不同體質量層次的大鼠隨機分至正常組、模型組、甲氨蝶呤組（MTX 組）和電針組，每組15 只。

1.2 主要試劑與儀器

礦物油(湖南惟世爾科技有限公司)；滅活結核桿菌(美國Difco 實驗室)；異氟烷(上海佳行股份有限公司)；AIMS 型動物紋身儀(深圳Reward 公司)；RWD510 型小動物呼吸麻醉機(山東格萊特股份有限公司)；移液槍(杭州雷琪實驗器材有限公司)；Hamilton 250 μL 型微量注射器(北京Bloning 有限公司)；足腫測量儀(MGO37140 UGO Basile)；bt701-1b 型電針治療儀(蘇州醫療用品廠制造)。

1.3 佐劑制備[2]

高溫滅菌后的干燥研缽置于精密天平上準確稱取結核桿菌15 mg；用移液槍精密吸取礦物油12 mL加入研缽中充分研磨，直至礦物油清亮無明顯懸浮雜質；將研磨好的MT 懸浮液移入EP 管中，經震蕩儀混合均勻后，稀釋、分裝，配備成濃度為1.25 mg/mL的MT 懸浮液（以上操作均在通風櫥中進行）。

1.4 AA 大鼠模型制備[2]

用小動物呼吸麻醉機將大鼠淺麻醉完畢后，將大鼠取出并固定，以酒精棉擦拭大鼠尾根部，并在尾根部皮下注射0.1 mL 佐劑，出針、按壓片刻，造模完成。

1.5 模型制備成功的標志[3]

正式實驗開始前進行預備實驗，相較于正常組大鼠而言，致炎大鼠從第3 天開始逐步出現炎性相關的癥狀，例如皮溫升高、尾部破潰等；隨著時間的推延，癥狀持續加重，第9～12 天，造模后的大鼠（模型組為甚）出現明顯致炎癥狀：皮毛散亂、皮溫升高、體質量減輕且尾部多處潰爛，足爪各關節有不同程度的腫脹，以上現象提示造模成功。

1.6 取穴與治療方法

取穴定位方法：參照“十三五”國家規劃統編教材《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜定位及擬人對照法定位[4]。 足三里：位于小腿外側，膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm；關元：從胸劍聯合至恥骨聯合上緣以松緊帶平均分為13 等份（每一等分模擬大鼠同身寸一寸），關元為恥骨聯合上緣3 寸；阿是穴：取關節周圍腫脹嚴重部位。（1）電針組[5]：用剃毛器將電針組每只大鼠的關元、兩側足三里及其附近的毛發清理，從造模后的第1 天起在每日的上午9～11點進行治療。 將大鼠固定后，以半寸毫針刺于兩側足三里、關元穴以及1 個阿是穴，深度3 mm 左右。 每只大鼠接兩組電針：“足三里(左)+關元穴”“足三里(右)+阿是穴”為一組，設置疏密波，頻率為20/50 Hz，緩慢調節電流，以針身輕顫為宜，每次治療時間持續20 min，7 次/療程，共治療3 個療程21 d；（2）MTX組：MTX 灌胃治療，劑量為0.35 mg/kg，2 次/周，共給藥3 周；（3）正常組與模型組不作干預。

1.7 觀測指標及檢測方法

1.7.1 體質量 大鼠分組后立即對所有大鼠進行編號，隨后用電子稱測量并記錄每只大鼠的體質量作為基礎數據，在造模后的第12、15、18、21 天的同一時間點以同樣的方式對大鼠進行體質量檢測和記錄，整個實驗過程中共記錄5 次體質量的檢測。

1.7.2 足爪容積的測量 大鼠分組后在其踝關節外側進行紋身標記(該標記持續存在，無需重復打點)，隨后檢測初始的足爪容積，在此基礎上，實驗期間大鼠足爪容積的檢測時間與體質量的測量時間一致，共記錄5 次足爪容積的測量。

1.7.3 關節炎評分[6]該項指標的評價依賴對大鼠的耳部、尾部以及四肢各大、小關節進行仔細觀察，本研究中大鼠從造模的第12 天起，出現肉眼可觀察到的致炎反應，因此，評分操作亦自第12 天開始，并依次在造模后第15、18、21 天，對大鼠進行關節炎指數評分。 具體評分細則為：0 分，無關節紅腫；1 分，小趾關節的紅腫；2 分，足趾關節與小趾關節均有腫脹；3 分，踝關節以下的足趾關節及小趾關節腫脹；4 分，包括踝關節在內的全部足爪的腫脹。每只大鼠四肢均進行評分，將四肢分數累積，累積分數越高則提示炎癥越嚴重。 最高分累計為16 分。

1.7.4 踝關節HE 染色及Western-Blot 檢測 造模后第22 天結束實驗并取材，將大鼠用10%的水合氯醛麻醉后沿膝關節處離斷后爪，全部大鼠左側踝關節用于HE 染色，右側踝關節用于檢測踝關節滑膜細胞胞漿中IκB 磷酸化水平及其重要相關蛋白NF-κB 的含量。（1）踝關節HE 染色檢測：大鼠后爪浸泡、固定、脫鈣、沖洗、脫水、透明、浸臘、包埋、冷卻，再固定、切片、展片、撈片、烤片、染色、脫水、透明、封片觀察。（2）小動物手術器械完整剝離關節滑膜組織行Western-blot 檢測：第一步，進行蛋白提取；第二步，進行蛋白含量測定；第三步，進行Western-blot操作，包括電泳、轉膜、經孵育/曝光和圖片分析。

1.8 統計學分析

實驗完成后所得數據均由SPSS 19.0 進行分析，計量資料以“±s”表示，并進行正態性與方差齊性分析，對非正態分布的數據以秩和檢驗分析，正態分布且方差齊性者用LSD 方法，正態分布但方差不齊者用多元方差分析方法。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

致炎的大鼠先后出現納差、少動、情緒激惹、皮毛松散等現象，以模型組最明顯。 數據統計分析結果：（1）體質量：造模后的第12、15、18、21 天分別對大鼠進行體質量的測量，與正常組比較，模型組體質量顯著減輕（P＜0.01），電針組、MTX 組差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，電針組、MTX 組大鼠的體質量在以上時段的測量中均顯著高于模型（P＜0.05）。 （2）足爪容積：對各組大鼠第12、15、18、21 天足爪容積測量數據的統計分析：與正常組比較，模型組存在明顯腫脹（P＜0.01），電針組亦存在腫脹（P＜0.05）；與模型組比較，MTX 組大鼠足趾關節的腫脹顯著減輕（P＜0.01），電針組腫脹程度亦有減輕（P＜0.05）。 （3）關節炎指數評分：自造模后的第12、15、18、21 天分別進行關節炎指數評分。數據分析顯示：與正常組比較，模型組、電針組的關節炎評分均存在顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，電針組關節炎指數則明顯低于模型組（P＜0.05）。 見圖1。

2.2 各組大鼠關節病理檢查結果

HE 染色結果顯示，正常組大鼠踝關節結構完好，骨骼線清晰，關節間隙適中，滑膜生長正常；模型組大鼠踝關節結構有明顯的改變，關節間隙明顯狹窄，關節滑膜增生和骨質破壞嚴重；另一方面，與模型組比較，MTX 組與電針組大鼠的踝關節結構保留較為完整，受破壞程度較輕，而MTX 組的大鼠踝關節破壞情況較電針組輕。 見圖2。

2.3 滑膜細胞胞漿內IκB、PIκB 及胞核內NF-κB含量比較

與正常組比較，模型組大鼠細胞胞漿內的IκB顯著低于正常組（P＜0.01），磷酸化的IκB（P-IκB）以及胞核內NF-κB 則顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠細胞胞漿內IκB 含量與模型組差異無統計學意義（P＞0.05），P-IκB 含量則低于模型組（P＜0.05），而胞核內NF-κB 亦低于模型組（P＜0.01）。 見圖3-4。

圖1 各組大鼠一般情況比較

圖2 各組大鼠踝關節HE 染色病理切片結果比較（HE，×40）

圖3 各組大鼠關節滑膜細胞胞漿內IκB、PIκB，胞核內NF-κB 比較

圖4 各組IκB、PIκB、胞核內NF-κB、β-actin 電泳圖

3 討論

已有研究證實[7-8]，NF-κB 對RA 的發生和發展主要體現在：一方面某些炎癥因子例如TNF-α 的存在，會刺激和啟動NF-κB 進行強烈的炎性反應，促成多種細胞因子、趨化因子、黏附分子的過度表達，使炎癥反應迅猛而廣泛，關節滑膜細胞增生過度；且過度增生的滑膜組織亦將分泌多種炎性介質，反作用于NF-κB，使炎性反應更為強烈而形成正向循環，推動炎癥的惡化發展，使滑膜增生進一步加重；另一方面是活化的NF-κB 通路對滑膜細胞的凋亡起重要的抑制作用。對滑膜細胞凋亡起抑制作用的凋亡抑制蛋白c-IAP1 和c-IAP2 在NF-κB 被激活后，也會相應升高表達水平，阻止滑膜細胞進行正常的凋亡程序，導致滑膜細胞擁有腫瘤細胞的繁殖特性。 在過度增生和凋亡抑制的雙重作用下，滑膜組織最終入侵關節和骨組織，導致疼痛、關節變形、喪失勞動能力。

本實驗研究選擇電針大鼠足三里、關元和阿是穴，主要基于中醫學對RA 的認識和研究[9]，中醫學認為RA 屬“痹癥”，其病因包括“外因”和“內因”兩個部分，“外因”指“濕邪、風寒、居住不良、勞役過度、起居不節等”，而“內因”分為“先天享賦不足”和“后天之氣不足”兩方面，歷代醫家對RA 的治療均遵循了“扶正祛邪”的基本原則。 足三里為足陽明之脈的合土穴，可調理脾胃、補益氣血生化之源、固護后天之本。關元穴為任脈與足三陰經交會穴，有培腎固本、補益精血、調理沖任、固護先天之本的功效；另外，通過刺激阿是穴可以疏通經絡，刺激氣血運行，充分發揮經絡的治療作用，達到緩解疼痛、改善癥狀的目的。 另外，從分子生物學角度也證實[10-11]：電針能夠確切改善RA 病情的確和干預NF-κB 信號通路有關系，然而具體的干預環節的研究仍不夠深入和具體，其作用機制仍需進一步研究和探討。

相關文獻資料表明[12]：細胞胞漿內的IκB 主要作用是抑制NF-κB 信號通路的激活，在正常情況下IκB 通常和NF-κB 蛋白結合成無活性的復活體，防止NF-κB 蛋白進入胞核內進行復制后激活該炎性通路。 另外，即便有部分NF-κB 蛋白進入胞核內，IκB在一定程度上亦能對該蛋白的活動起到抑制作用[13]。因此，一旦機體由于某種原因導致IκB 磷酸化，IκB蛋白將迅速被水解，從NF-κB 與IκB 復合體上脫落，解除了抑制的NF-κB 則迅速進入細胞核內，與相應的κB 位點結合，實現對相關基因的表達調控，從而啟動一系列炎癥相關反應。由此可見，NF-κB 信號通路能夠被激活，與IκB 的磷酸化有著密切聯系：P-IκB 在細胞胞漿內表達低者，胞核內NF-κB 表達量也低；而P-IκB 表達越高者，則胞核內NF-κB 的表達也相應高。 本實驗研究結果亦證實了該理論。

本研究的結果表明，NF-κB 信號通路在模型組大鼠關節滑膜細胞內得到高度激活，而電針組以及MTX 組中大鼠踝關節滑膜細胞內該信號通路得到良性的調控，因其胞漿內的IκB 磷酸化水平均較模型組低，表明電針治療對抑制IκB 的磷酸化有較為明顯的作用，從一定程度上抑制了NF-κB 信號通路的活化，從而抑制關節滑膜的增生增殖，減輕炎癥反應，遏制類RA 的發生發展。 綜上，降低滑膜細胞胞漿內IκB 磷酸化水平，良性調控機體內NF-κB 這一炎癥信號通路，是電針有效對抗炎癥、治療RA 疾病的機制之一。