補中益氣湯對PC12 細胞線粒體DNA 部分缺失模型的保護作用

李騰輝，董一昕，閆鳳娜，王淑艷，王珊珊，于 雪，王 旭，許明陽，李衛紅*

（1.北京中醫藥大學中醫學院，北京100029；2.首都醫科大學附屬北京地壇醫院，北京100020）

中醫學認為氣是構成人體和維持人體生命活動的最基本物質，人體的精微物質血、津液和精等均由氣所化生[1]。氣通過推動、溫煦作用，對人體的生長發育以及各臟腑組織器官的生理活動均具有激發和促進作用[2]。線粒體通過氧化磷酸化過程合成ATP，為細胞的各種生命活動提供能量，是人體“動力工廠”。當線粒體功能障礙時，機體會出現“氣虛”的相關癥狀。由于中醫“氣”和線粒體在功能和病理表現上的高度一致性，有學者提出了“氣-線粒體”相關學說[3-4]，提示改善線粒體損傷可能是補氣藥物發揮療效的內在機制。

中樞神經系統代謝旺盛，能量需求高，神經細胞線粒體含量豐富[5]。線粒體是除了動物細胞核之外唯一含有DNA 的細胞器，但由于線粒體DNA（mtDNA）缺乏組蛋白的保護，極易受到氧自由基等因素損傷發生缺失突變，導致線粒體能量代謝功能異常[6]。因此，本實驗采用具有神經細胞特征的PC12 細胞，通過建立mtDNA 部分缺失細胞模型，觀察補中益氣湯對線粒體損傷的作用及其內在機制，為揭示中醫“補氣”療法的生物內涵提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物

補中益氣湯：黃芪15 g，炙甘草15 g，人參9 g，當歸6 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術9 g，均購自北京同仁堂。補中益氣湯母液制備：將補中益氣湯飲片加適量水浸泡0.5 h，煎煮兩次，合并兩次藥液濃縮至含生藥315 mg/mL 的母液，過濾除菌4 ℃保存備用。 達納康母液制備：達納康作為陽性對照藥，制備成總有效成分0.4 mg/mL 的母液，4 ℃保存以備用。

1.2 細胞

PC12 細胞（大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株）購自北京協和細胞庫。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM、胎牛血清(Gibco 公司)；馬血清（拜爾迪公司）；溴化乙錠（蘭博利德公司）；丙酮酸、尿嘧啶（Sigma 公司）；CCK8 試劑盒（碧云天公司）；線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ-Ⅳ活性檢測試劑盒（索萊寶公司）；ATP 檢測試劑盒（碧云天公司）；DNA 提取試劑盒（艾科瑞公司）；RNA 檢測試劑盒（艾科瑞公司）。

實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；CO2培養箱（德國Eppendorf 公司）；酶標儀（美國BioTek公司）。

2 方法

2.1 PC12 細胞mtDNA 部分缺失模型建立

2.1.1 細胞活性檢測 將PC12 細胞按5×105/mL 密度接種于96 孔板，待細胞生長至對數期，吸棄舊培養基，除正常對照組外，其余各組加入不同終濃度（125、250、500、1 000、2 000 ng/mL）溴化乙錠，以及100 μg/mL 丙酮酸，50 μg/mL 尿嘧啶的培養基，48 h 后將細胞按照1×105/mL 密度接種于96 孔板中，每組設定6 個復孔，進行CCK8 檢測。 最終確定溴化乙錠的濃度為500 ng/mL 用于后續實驗。

2.1.2 mtDNA 拷貝數檢測 為證實mtDNA 的缺失情況，采用RT-PCR 法檢測線粒體單拷貝基因環氧合酶2（COX2）來代表mtDNA 拷貝數。500 ng/mL 濃度溴化乙錠造模完成后，收集細胞，采用DNA 提取試劑盒提取細胞DNA，檢測DNA 質量并測定濃度。擴增COX2 基因，引物大小為156 bp，正向引物序列為5′-TGGCTTACAAGACGCCACAT-3′，反向引物序列為5′-TGGGCGTCTATTGTGCTTGT-3′，核編碼基因β-actin 作為內參，引物大小為262 bp，正向引物序列為：5′-TTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，反向引物序列為5′-CGTACTCCTGCTTGCTGATC-3′。反應體系為2×SYBR Green Mix 10 μL，DNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，擴增程序為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，49 個循環。 采用2-△△Ct法進行結果計算。

2.2 實驗細胞分組與處理

將PC12 細胞分為4 組：正常組、模型組、達納康組、補中益氣湯組。除正常組外，其余3 組按“2.1”方法造模。造模完成后，模型組更換為無血清DMEM基本培養基。前期預實驗篩選出補中益氣湯和達納康的給藥濃度分別為16 mg/mL、100 ng/mL。補中益氣湯組和達納康組按照預實驗篩選出的藥物濃度進行給藥干預，24 h 后進行指標檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 細胞活性檢測 細胞分組處理完成后，吸棄舊培養基，用PBS 溶液輕柔清洗2 遍，加入90 μL DMEM 培養基和10 μL CCK8 檢測液，37 ℃孵育3 h，用酶標儀測定每孔在450 nm 處的OD 值。

2.3.2 線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性和ATP 含量測定 細胞分組處理完成后，用線粒體呼吸鏈復合物活性檢測試劑盒及ATP 檢測試劑盒，比色法檢測各組細胞線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書上的實驗步驟進行。

2.3.3 線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）mRNA 水平檢測 各組藥物作用完成后，收集細胞，采用RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，測定RNA 濃度并檢測純度。采用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA 模板，反轉錄反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，4 s，TFAM 引 物 大 小 為148 bp， 正向引物序列為5′-TTAGAGAAGGAAGC CCGGCA-3′， 反 向 引 物 序 列 為5′-GTGACTCATC CTTAGCCCCC-3′。內參GAPDH 引物大小為153 bp，正向引物序列為5′-CCATTCTTCCACCTTTGAT-3′，反向引物序列為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′。反應體系為2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，反應程序及結果計算方法同“2.1.2”。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 mtDNA 部分缺失模型中溴化乙啶濃度的確定

與正常組比較，溴化乙啶各濃度組OD 值均降低(P＜0.001)，呈現出線性量效關系，表明溴化乙錠引起線粒體活性下降。實驗中發現，由于溴化乙錠對細胞毒性較大，1 000 ng/mL、2 000 ng/mL 濃度組細胞造模后死亡較多，藥物治療很難挽救，故選擇中間劑量500 ng/mL 溴化乙啶作為本實驗的造模濃度。見表1。

表1 不同濃度溴化乙啶對PC12 細胞活性的影響（±s,n=6）

表1 不同濃度溴化乙啶對PC12 細胞活性的影響（±s,n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.001

組別正常組125 ng/mL 250 ng/mL 500 ng/mL 1 000 ng/mL 2 000 ng/mL OD 值1.55±0.07 0.77±0.05**0.50±0.05**0.41±0.06**0.35±0.02**0.33±0.02**

3.2 mtDNA 拷貝數檢測

正常組細胞形態呈橢圓狀或錐形，折光性良好，細胞貼壁性好，有聚成小團簇狀生長的傾向（圖1A）；模型組細胞貼壁性較差，部分細胞懸浮在培養液中，提示出現細胞損傷狀態（圖1B）。

圖1 細胞形態圖（×100）

與正常組相比，模型組PC12 細胞COX2 基因表達明顯下降（P＜0.01），提示mtDNA 拷貝數下降，表明500 ng/mL 濃度溴化乙錠造模造成了PC12 細胞線粒體部分DNA 缺失。 見圖2。

3.3 各組細胞線粒體活性的檢測結果

圖2 mtDNA 拷貝數檢測結果

與正常組比較，模型組細胞線粒體活性顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，達納康組和補中益氣湯組細胞活性顯著升高（P＜0.01），提示補中益氣湯可以改善mtDNA 缺失造成的細胞活性下降。 見表2。

表2 各組PC12 細胞線粒體活性檢測結果（±s,n=10）

表2 各組PC12 細胞線粒體活性檢測結果（±s,n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別正常組模型組達納康組補中益氣湯組OD 值2.27±0.27 0.52±0.11**2.02±0.22▲▲2.14±0.17▲▲

3.4 線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性檢測結果

與正常組比較，模型組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，達納康組和補中益氣湯組線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性顯著升高（P＜0.01），復合物Ⅲ活性有升高趨勢，但組間無顯著差異，結果見圖3。

3.5 各組細胞線粒體ATP 含量

與正常組比較，模型組細胞ATP 含量顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.001)；與模型組比較，達納康組和補中益氣湯組細胞線粒體ATP 含量顯著回升(P＜0.001)，表明兩種藥物干預后細胞線粒體能量代謝功能有所恢復。 見表3。

3.6 TFAM mRNA 表達水平

與正常組比較，模型組TFAM mRNA 表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，達納康組和補中益氣湯組TFAM mRNA 表達顯著升高（P＜0.01）。 見圖4。

4 討論

中醫理論認為氣是一種肉眼不可見的精微物質，可以通過生理功能和病理現象來感知生命物質的存在[7]。 現代研究認為，線粒體是細胞進行能量代謝的主要場所，線粒體呼吸鏈經過一系列的電子和氫離子傳遞產生ATP，可以為細胞生存提供95%以上能量，對所在組織、器官和生命質量產生重要影響[8]。正如氣一樣人體生命狀態會隨著線粒體功能的變化而改變，線粒體也載負著生命現象。故中醫學中的氣與線粒體功能和作用的統一性逐漸成為現代中醫學者的共識[7-9]。

表3 各組細胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

表3 各組細胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

ATP 含量836.16±12.76 244.17±8.00**804.60±13.55▲▲815.70±16.70▲▲組別正常組模型組達納康組補中益氣湯組

圖4 各組TFAM mRNA 表達水平

腦為“元神之府”，主宰人體的生命活動。隨著機體衰老，髓減腦消，神機失用會對人的生活質量造成極大的影響。有報道指出，老年小鼠的腦和海馬組織內mtDNA 缺失的比例較青年幼鼠明顯增加，mtDNA缺失與年齡相關的退行性病變的發生密切相關[10-11]。由于mtDNA 沒有內含子，任何形式的突變都可能會造成mtDNA 序列改變，導致線粒體能量生成障礙，出現學習記憶功能降低、精神意識障礙等現象[12]。因此，有人認為mtDNA 突變可能是導致衰老和神經退行性疾病的重要因素[13]。為探討大腦mtDNA 缺失對線粒體的功能影響，本實驗采用PC12 大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株（它具有神經內分泌細胞的一般特征，被廣泛應用于神經藥理研究）建立了mtDNA 部分缺失細胞模型。造模采用經典的溴化乙錠誘導法，溴化乙錠可插入mtDNA 內部，逐步減少mtDNA 的復制，但不影響核DNA 的復制[14]。 以往線粒體mtDNA 研究多采用線粒體缺失細胞株Rho0(ρ0)，即通過長時間的溴化乙錠干預造成mtDNA 完全缺失[15]，這種“全或無”細胞模型無法研究mtDNA不同拷貝數對疾病的影響，不適用于衰老、疲勞綜合征等線粒體部分受損疾病的研究[16]。 故本實驗采用500 ng/mL 濃度的溴化乙錠進行造模，并通過檢測mtDNA 拷貝數證實該濃度可造成mtDNA 部分缺失，建立更適于中醫“氣虛證”相關疾病研究的mtDNA 部分缺失模型。

線粒體呼吸鏈通過一系列遞氫、遞電子反應和氧化還原反應形成能量提供給細胞[17]，一定程度上體現了氣的推動作用。 本實驗采用李東垣創立的補氣代表方“補中益氣湯”作為治療藥物[18-19]，觀察它對線粒體功能的影響。前期預實驗發現，在到達最佳給藥濃度之前，補中益氣湯組和達納康組細胞活性會隨藥物濃度的升高而增強，之后二者呈反比關系，提示兩個治療藥物在一定范圍內對細胞活性有改善作用。與正常組相比，模型組的線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性和ATP 含量明顯下降，提示mtDNA部分缺失導致線粒體呼吸功能障礙可能與這3 個復合物有關。線粒體復合物Ⅰ的7 個亞基、復合物Ⅳ的2 個亞基和ATP 合酶F0 結構的2 個亞基由mtDNA自己編碼，受mtDNA 缺失影響較大。 與模型組相比，補中益氣湯可顯著增強呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性，這可能是補中益氣湯改善線粒體功能的作用環節之一。復合物Ⅰ主要把氫或電子從輔酶I（NADH）傳遞給輔酶Q（CoQ），同時將4 個氫離子從線粒體內膜內側泵到膜間隙，復合體Ⅱ的主要功能是將電子從琥珀酸傳遞給CoQ，然后傳遞給復合物Ⅲ，再通過Cytc 將電子傳遞到復合體Ⅳ， 驅動ADP 和Pi合成ATP[20]。 與模型組相比，補中益氣湯組ATP 含量增高，與陽性藥達納康效果相近，提示線粒體呼吸鏈整體功能改善。

TFAM 是一種由細胞核基因編碼的線粒體蛋白質。 TFAM 可以通過包裹mtDNA，形成類似組蛋白的核樣結構，使其免受氧化損傷，同時促進mtDNA的復制，調節拷貝數，起到保護mtDNA 的作用[21]。線粒體功能紊亂與許多線粒體疾病、腫瘤的發生發展、神經退行性疾病和衰老等密切相關,TFAM 在相關疾病的治療中起到了關鍵作用[22]。 有報道稱在前腦神經細胞中TFAM 的基因敲除可導致mtDNA 和線粒體轉錄的減少以及嚴重的呼吸鏈缺陷，從而導致神經退行性疾病和明顯的行為失調[23]。 本實驗結果顯示，與模型組相比，補中益氣湯組的TFAM 表達顯著提高，提示上調TFAM 表達可能是補中益氣湯發揮線粒體保護作用的內在機制之一。

綜上所述，本實驗通過觀察補中益氣湯對PC12細胞mtDNA 部分缺失模型的影響，發現補氣藥物可能通過改善線粒體呼吸鏈功能和mtDNA 修復對線粒體損傷起到保護作用，為補氣藥治療mtDNA 部分缺失引起的相關疾病提供了實驗依據。另一方面，通過“以藥測證”的方法驗證了中醫氣與線粒體之間的密切相關性，為揭示中醫“氣”實質提供了證據支撐。