小柴胡湯“去滓重煎”對LPS 誘導發熱白兔模型體溫及血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

蘭 斌，張 鈺，龍 睿，丑天舒*（湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

小柴胡湯是臨床用于治療發熱病癥的經典方劑，但近年來常存在“病準方對藥不靈”的情況，即辨證施治準確但臨床療效卻不理想[1-2]。 正如李時珍[3]的《本草綱目》中云：“凡服湯藥，雖品物專精，修治如法，而煎藥者魯莽造次，水火不良，火候失度，則藥亦無功。 ”北宋醫家沈括[4]在《良方》中論煎煮湯劑必“煮煉有節”，表明煎煮方法的正確選擇能夠確保經方的臨床療效。“去滓重煎”法首見于《傷寒論》中，是一類特殊的濃縮煎煮法，自漢末以來就被歷代醫家所認可，可使藥液濃縮，減輕患者胃腸刺激[5-6]。 前期臨床研究發現，運用小柴胡湯“水煎服”治療臨床發熱的2829 例中，嚴格按照原文要求“去滓重煎”的僅29 例，約占總體的1%，而痊愈者占總數的49.13%，提示臨床上不規范的煎煮方式可能導致藥效作用的減弱甚至喪失[7-8]。 本課題通過觀察小柴胡湯去滓重煎對脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導新西蘭兔發熱模型體溫及血清中白細胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平的影響，探討小柴胡湯“去滓重煎”治療發熱的作用機制，為臨床解熱提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康新西蘭兔50 只，雌雄各半，體質量（1.5±0.5） kg，由湖南太平生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2015-0004，動物質量合格證號：1107301911000138。 實驗動物飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心飼養室，室溫（25±2） ℃，濕度45%～65%，許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。 符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》，并經湖南中醫藥大學醫學實驗動物倫理委員會審查和批準。

1.2 主要儀器與試劑

漩渦混勻儀（型號：MIX-25P，武漢華聯科生物技術有限公司）；電子秤（武漢華聯科生物技術有限公司）；肛溫計（安徽方達藥械有限公司）；EDTA 抗凝管（三力醫用科技發展有限公司）；5 mL 普通試管（南京瑞崛儀器設備有限公司）。

IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA（批號：L150707213）均產自武漢優爾生科技有限公司，由上海朗頓生物技術有限公司提供。 LPS（Escherichca coli endotoxin 055：B5，美國Sigma 公司，批號1010A031）用無菌生理鹽水溶解成2 μg·mL-1溶液。阿司匹林（拜耳醫藥保健有限公司，批號J20130078）用無菌生理鹽水溶解成0.13 g·mL-1。 水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號20160113）用無菌生理鹽水溶解成10%溶液。

1.3 中藥材的選取與制備

小柴胡湯組成：北柴胡.24 g，青半夏9 g，黃芩9 g，人 參9 g，炙甘草6 g，生姜9 g 和大棗10 g，按照《中華人民共和國藥典》（2015 版）藥材標準，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。

小柴胡湯普通煎煮法制備藥液：取小柴胡湯干燥飲片一劑，加入760 mL 水，浸泡40 min，大火煎煮至沸騰40 min 后，過濾并取藥渣，將藥渣同法再煎煮2 次，合并3 次藥液，并將所得藥液用雙層紗布過濾，再煎取600 mL，生藥濃度為0.13 g·mL-1。

小柴胡湯“去滓重煎”法制備藥液：取小柴胡湯干燥飲片一劑，加入2 400 mL 水，煎煮至1 200 mL后濾掉藥渣，將所得藥液再煎煮至600 mL，生藥濃度為0.13 g·mL-1。

1.4 動物分組及模型建立

選取50 只新西蘭白兔在實驗環境中喂養1 周（自由取食、飲水和光照等），再將其隨機分為5 組：正常組、模型組、小柴胡湯原液組、小柴胡湯“去滓重煎”組和阿司匹林組，每組10 只。實驗前，新西蘭兔禁食、不禁水12 h。 正常組經耳緣靜脈注射同等體積生理鹽水，其余組動物以0.3 mL·kg-1劑量經耳緣靜脈注射濃度為2 μg·mL-1的LPS 水溶液，完成發熱模型建立。

1.5 動物給藥處理

造模成功后，新西蘭兔灌胃劑量按照“人與動物體表面積折算等效劑量”進行灌服給藥。小柴胡湯原液組：按0.32 g·kg-1劑量灌服普通煎煮法所得的水煎液5 mL；小柴胡湯去滓重煎組：按0.32 g·kg-1劑量灌服“去滓重煎”法所得的水煎液5 mL；阿司匹林組：按0.32 g·kg-1劑量灌服阿司匹林水溶液5 mL；正常組與模型組灌服同等體積生理鹽水5 mL；均早、晚灌服1 次。

1.6 指標檢測

1.6.1 各組新西蘭兔體溫在不同時間點體溫值 造模前，連續3 d 早、晚測量各組新西蘭兔肛溫（測溫探頭插入肛門4 cm）2 次，并取3 d 平均值作為新西蘭兔的基礎體溫（T0）。 各組新西蘭兔經灌服給藥后，每隔0.5 h 監測新西蘭兔肛溫（T1），連續觀測2 h，記錄各組平均體溫變化△T（△T =T1-T0）。

1.6.2 各組新西蘭兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量 經白兔耳緣靜脈采血入5 mL 普通試管內，室溫靜置4 h， 以3 500 r/min 轉速于4 ℃離心15 min，分離出血清后。再嚴格按ELISA 試劑盒內操作程序，運用ELISA 法檢測新西蘭兔血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量。

1.6.3 各組新西蘭兔中白細胞和嗜中性粒細胞水平 測量最后1 次體溫后，采用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉。經白兔耳緣靜脈采血入EDTA 抗凝管中，輕輕搖晃使抗凝素與血液完全混合，再通過血細胞檢測分析儀進行自動檢測白細胞和中性粒細胞數量，并記錄讀數。

1.7 統計學處理方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析，各組數據均以“±s”表示，多組間數據經方差齊性檢驗后，兩組間比較采用單因素方差分析，檢驗水平α=0.05，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組新西蘭兔在不同時間點的體溫值變化

與正常組比較，各組新西蘭兔在造模30 min 后開始發熱，皮膚溫度逐漸升高（P＜0.05），結膜充血并出現發抖、蜷縮；1.5 h 后，各組新西蘭兔體溫明顯上升（P＜0.01），皮溫升高，呼吸急促，結膜充血嚴重，運動行為萎靡。與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組在各時間點的癥狀都有明顯改善以及體溫下降（P＜0.05）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組在1.5 h 和2 h 時間節點的體溫低于小柴胡湯原液組（P＜0.05）。 見表1。

表1 各組新西蘭兔注射LPS 后體溫在不同時間點△T 值變化(℃，±s,n=10）

表1 各組新西蘭兔注射LPS 后體溫在不同時間點△T 值變化(℃，±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值30 min 0.24±0.07 0.80±0.38*0.37±0.29#0.31±0.37##0.77±0.23#235.418 0.000 1 h 0.24±0.09 0.84±0.21*0.68±0.39#0.72±0.34#0.78±0.21#199.445 0.012 1.5 h 0.23±0.10 1.48±0.34**1.05±0.29#0.63±0.31##△0.89±0.20##△217.613 0.000 2 h 0.24±0.09 0.81±0.21**0.72±0.32#0.35±0.54##△0.75±0.21#203.756 0.000

2.2 小柴胡湯“去滓重煎”對發熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

與正常組比較，模型組血清IL-1β、IL-6 和TNFα 含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量均下降（P＜0.05 或P＜0.01）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡湯原液組（P＜0.05）。 見表2。

表2 小柴胡湯“去滓重煎”對發熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s,n=10,ng·L-1）

表2 小柴胡湯“去滓重煎”對發熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s,n=10,ng·L-1）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值IL-1β 11.33±3.89 36.44±9.23**24.98±3.97#16.80±2.24##△11.65±2.74##△△43.734 0.000 IL-6 36.63±10.2 131.36±21.22**100.71±12.50#63.83±11.29##△55.45±14.98##△△51.453 0.000 TNF-α 47.19±10.50 220.89±26.33**149.05±18.51#83.34±27.21##△69.56±20.08##△△131.794 0.000

2.3 各組新西蘭兔中白細胞和嗜中性粒細胞變化

與正常組比較，模型組白細胞和嗜中性粒細胞數目均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組白細胞和嗜中性粒細胞數目均有所降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組白細胞和嗜中性粒細胞數目差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表3。

表3 各組新西蘭兔中白細胞和嗜中性粒細胞變化(±s,n=10）

表3 各組新西蘭兔中白細胞和嗜中性粒細胞變化(±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值白細胞計數/（×109/L-1）16.8±1.11 21.19±1.23*7.73±4.18##7.94±4.48##12.76±8.52#15.601 0.026嗜中性粒細胞計數/（×109/L-1）4.00±0.70 9.51±4.02*5.66±4.00##6.53±3.82#10.83±8.00 15.850 0.027嗜中性粒細胞百分比/%51.05±3.87 77.19±7.50*75.00±4.30#80.91±4.82 80.86±11.87 20.772 0.328

3 討論

發熱是由于內、外致熱源通過中樞發熱介質作用于體溫調節中樞，促使體溫調定點上移而引起的調節性體溫升高[9-10]。 LPS 作為革蘭陰性細菌內毒素的活性成分，是誘導強發熱的主要外源性致熱源，通過作用于機體內巨噬細胞，促使其產生IL-1β、IL-6和TNF-α 等重要的炎性遞質，從而引起機體的強烈炎癥反應，促使體溫升高[11-12]。 前期研究表明，在眾多動物模型中，新西蘭兔對內毒素的生物學反應與人類最為接近。在本實驗研究中，我們選取新西蘭兔作為實驗對象，以0.6 μg·kg-1劑量經耳緣靜脈注射濃度為2 μg·mL-1的LPS 建立新西蘭兔發熱模型。結果顯示各組新西蘭兔在造模30 min 后開始發熱，皮膚溫度逐漸升高，結膜充血并出現發抖、蜷縮；1.5 h后，各組新西蘭兔體溫明顯上升，皮溫升高，呼吸急促，結膜充血嚴重，運動行為萎靡，且模型組血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量均顯著升高，白細胞和嗜中性粒細胞數目均顯著升高，提示模型建立成功。

小柴胡湯出自東漢張仲景《傷寒論》中“和”法的經典方，廣泛用于臨床治療發熱性病證。方中柴胡味辛微苦，氣質薄且味稍輕，煎煮時常溶出且升散。 半夏性溫味辛、氣平微苦，可開結氣，降逆氣，消正邪之搏結。 黃芩可除少陽郁熱，再配以生姜之辛溫，以助柴胡、半夏樞轉開結。加大棗、人參、炙甘草等味甘之類，以扶正達邪，并緩其溫散之勢，且制約黃芩苦寒傷正[13]。 “去滓重煎”法首見于《傷寒論》：“以水一斗二升，煮取六升，去滓，再煎取三升”，煎煮時，所需湯藥之量更少，減少了對胃腸道的刺激，避免停飲致嘔，能達到調和方中藥性寒溫之差，味苦辛甘之異，功用祛邪扶正之別[14-15]。 現代藥理學研究發現，通過高效液相色譜法測定小柴胡湯“去滓重煎”法中黃芩的有效化學成分（如黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等）含量明顯高于不去滓煎法（P＜0.05），且溶液中柴胡皂苷a、b1、d 含量及抗炎效果明顯優于傳統“水煎服”法（P＜0.05）[16-17]。

本研究通過選取小柴胡湯干燥飲片，經“去滓重煎”后的濃縮液治療LPS 誘導的新西蘭兔發熱模型。 結果發現小柴胡湯“去滓重煎”組新西蘭兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡湯原液組；小柴胡湯原液和小柴胡湯去滓重煎液均能有效降低模型組白細胞和嗜中性粒細胞數目；但小柴胡湯去滓重煎組在1.5 h 和2 h 時間節點的體溫明顯低于小柴胡湯原液組，且解熱效果更佳，可能主要與小柴胡湯“去滓重煎”液降低血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量有關；小柴胡湯“去滓重煎”時，湯液中有效成分并不增加，但繼續煎煮過程中，藥物屬氣、屬陽的成分相對于屬陰、屬味的成分易偏于升散，更多地揮發而丟失，則味分之藥物成分得到保存，既取藥物之氣，又留藥物之味，使藥物間陰陽調和，補瀉相和，更好地發揮了和解少陽之功[18-19]。

本實驗研究探討了小柴胡湯“去滓重煎”的解熱效果及血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影響，為臨床應用小柴胡湯“去滓重煎”法治療發熱提供了一定的實驗依據，無論是從理論基礎，還是解熱療效，都說明了小柴胡湯“去滓重煎”法在臨床應用中的潛在價值，但其機制仍需深入研究。