桃紅四物湯組方藥物主要有效單體成分配伍對早期骨折愈合的影響

楊 卓，邱振南，余曉愉，周文佳，閆春曉，齊新宇，徐無忌，熊 輝*

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208；2.瀏陽市中醫院，湖南 瀏陽410301；3.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410005）

隨著人們生活節奏的加快及交通水平的不斷提高，骨折成了臨床的常見病、多發病，各種并發癥的概率也在逐漸增加[1-2]。 由于骨折的愈合是一個漫長的過程，所以國內外學者針對中醫藥促進骨折愈合進行了大量相關研究[3]。 桃紅四物湯載于清代醫家吳謙所著之《醫宗金鑒》，是活血化瘀的代表方之一。本課題組前期研究表明，該方具有良好的促進早期骨折愈合的作用，主要表現在促進成骨細胞生長、加速骨小梁重建、促進骨痂微血管新生、提高骨痂血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表達[4]。王慧卓等[5]研究發現，大鼠灌胃桃紅四物湯后，液相色譜-串聯質譜法測得血液中有效單體成分主要有芍藥苷、芍藥內酯苷、梓醇、阿魏酸、藁本內酯和苦杏仁苷6 種。本研究擬從桃紅四物湯中藥物主要有效單體成分配伍角度，探討其對大鼠早期骨折愈合的影響及其作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級健康2 月齡SD 雄性大鼠60 只，體質量為（200±20） g，訂購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：SYXK＜湘＞2016-0002。 各組大鼠均分籠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2 主要藥物及試劑

4%的乙二胺四乙酸（EDTA）（上海生工生物工程有限公司），鼠VEGF 試劑盒（上海森雄科技實業有限公司，G-W054），桃紅四物湯單體成分組方：苦杏仁苷（MUST-18042810）、阿 魏 酸（MUST-18032928）、羥基紅花黃色素A（MUST-18101910）、梓醇（MUST-18103011）、芍藥苷（MUST-18032901）、毛蕊花糖苷（MUST-18032725）、川芎嗪（MUST-18051403），以上成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，根據2015 版《中藥藥典》的劑量將苦杏仁苷35 mg、阿魏酸2.5 mg、羥基紅花黃色素A 15 mg、梓醇3 mg、芍藥苷31 mg、毛蕊花糖苷1 mg、川芎嗪1.5 mg 溶于水配成單體組方，和桃紅四物湯水煎劑等體積灌胃。 桃紅四物湯：桃仁20 g，紅花10 g，生地黃20 g，當歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，由湖南省第二附屬醫院中藥房提供，符合2015 版《中華人民共和國藥典》要求。藥物制備：加10 倍量水浸泡0.5 h，用電熱套加熱回流提取1 h，趁熱濾過；第2 次加8 倍量水，同法再煮1 h。合并兩次煎液，藥物濃縮至每1 mL中含復方中藥0.6 g。

1.3 主要儀器

ER-182 A 型電子天平（日本AND 公司），顯微鏡（日本Motic 公司 ），石蠟切片機（德國LABSTAR公司），旋轉蒸發器RE-2000B（上海亞榮生化儀器廠），顯微CT（美國Perkin Elmer 公司）。

2 方法

2.1 動物造模及分組

將60 只SD 雄性大鼠飼養1 周后，參照文獻[6]造模，具體方法如下：腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取俯臥位將大鼠固定于無菌操作臺上。 備皮，常規消毒。 于大鼠左股外側作一長約3 cm 的縱行切口，逐層鈍性分離后充分暴露股骨干；定位至股骨干中段，先用骨鋸鋸斷股骨，后改用止血鉗折斷股骨干，以保持斷端完整。由斷端進針，同側股骨大轉子出針，于股骨干近端逆行插入一根直徑為1 mm的克氏針復位，然后順行穿回，完成復位后，彎折其根部，剪去多余部分，隨后縫合傷口。 術中剔除粉碎性骨折大鼠，重新造模補充至所需樣本量。 觀察大鼠情況，確認無術后死亡后回籠飼養，正常飲水攝食，予青霉素腹腔注射3 d，防止感染。 將大鼠隨機分為5 組，每組12 只：空白組（A 組，不做處理，灌胃等量生理鹽水）、假手術組（B 組，只切開不截斷，灌胃等量生理鹽水）、模型組（C 組，造模，灌胃等量生理鹽水）、原方水提組（D 組，造模，灌胃原方水煎劑）、單體成分組（E 組，造模，灌胃原方主要單體成分組方）。

2.2 藥物干預

大鼠每日灌胃量為3 mL/只，劑量為9 g/(kg·d)。原方水提組及單體成分組按等劑量灌胃相應藥液；模型組、假手術組及空白組灌胃等量的生理鹽水。各組連續灌胃10 d，每天灌胃2 次，2 次灌胃間隔8 h。

2.3 樣本采集

在大鼠造模后第4、7、10 天，每組隨機選擇4 只大鼠，麻醉后經腹主動脈采血后用斷頸處死大鼠，取出左側股骨（造模處），多聚甲醛固定，固定后脫鈣。

2.4 大鼠肢體腫脹度測定

分別于造模前和造模后第4、7、10 天在左股骨中段同一位置剔除毛發，用紅線纏上進行標記，并用不銹鋼帶表卡尺測量，每只大鼠均需要重復3 次，得到平均值。

2.5 大鼠血清VEGF 濃度的測定

造模后第4、7、10 天使用ELISA 檢測各組大鼠血清VEGF 的濃度，每組檢測4 只，取平均值，具體操作按說明書進行。

2.6 骨體積和骨性骨痂體積百分比測定

通過顯微CT（Micro-CT）進行掃描，將造模后第4、7、10 天大鼠股骨中段骨折位置和骨折處周圍的骨進行三維重建分析，可測得骨體積（bone volume, BV）和骨性骨痂體積(total volume, TV)百分比（BV/TV%）。

2.7 HE 染色觀察骨折早期斷端病理形態變化

用75%、85%、95%、100%的乙醇梯度依次脫水各30 min，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下分別觀察造模后第4、7、10 天骨折斷端病理形態變化。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 桃紅四物湯對大鼠肢體腫脹度的影響

與空白組比較，假手術組肢體腫脹度差異無統計學意義（P＞0.05），模型組、原方水提組、單體成分組肢體腫脹度在造模后、灌胃第4、7 天大鼠肢體腫脹度均顯著增加（P＜0.05），原方水提組、單體成分組在灌胃第10 天差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組相比，單體成分組與原方水提組大鼠肢體腫脹度在造模后差異無統計學意義（P＞0.05），在灌胃第4、7、10 天明顯降低（P＜0.05）。 與原方水提組比較，單體成分組肢體腫脹度在造模后、灌胃第4、7、10 天差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 大鼠股骨中段腫脹度變化（n=4，±s，cm）

表1 大鼠股骨中段腫脹度變化（n=4，±s，cm）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

組別空白組假手術組模型組原方水提組單體成分組灌胃第10 天4.12±0.33 4.10±0.41 4.93±0.29★4.21±0.40●4.17±0.32●造模后4.04±0.42 4.51±0.56 5.52±0.38★5.45±0.25★5.46±0.33★灌胃第4 天4.07±0.24 4.42±0.47 5.37±0.55★4.95±0.43★●4.81±0.51★●灌胃第7 天4.10±0.54 4.29±0.23 5.01±0.40★4.63±0.21★●4.72±0.53★●

3.2 桃紅四物湯對大鼠血清VEGF 濃度的影響

與空白組比較，假手術組大鼠血清VEGF 濃度差異無統計學意義（P＞0.05），模型組、原方水提組、單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10天均顯著增加（P＜0.05）。 與模型組比較，原方水提組、單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天均顯著增加（P＜0.05）。 與原方水提組比較，單體成分組大鼠血清VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 不同時相點血清VEGF 濃度含量統計分析（n=4，±s）

表2 不同時相點血清VEGF 濃度含量統計分析（n=4，±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，●P＜0.05

組別空白組假手術組模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天123.65±3.61 130.17±1.67 162.32±5.34★235.18±5.09★●229.34±3.82★●灌胃第7 天122.76±2.73 125.30±2.54 197.90±7.79★335.56±4.71★●341.38±5.84★●灌胃第10 天124.04±1.89 123.15±3.01 225.68±2.54★476.74±3.82★●462.31±5.22★●

3.3 桃紅四物湯對大鼠BV、BV/TV%的影響

與模型組比較，原方水提組、單體成分組BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天均顯著增加（P＜0.05）。與原方水提組比較，單體成分組BV、BV/TV%在灌胃第4、7、10 天差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3-4、圖1。

表3 大鼠術后BV 變化（n=4，±s）

表3 大鼠術后BV 變化（n=4，±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05

組別模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天38.12±3.64 44.35±4.59▲46.23±3.34▲灌胃第7 天42.56±3.12 53.23±3.24▲54.21±3.71▲灌胃第10 天50.12±4.72 76.43±3.89▲78.52±4.76▲

3.4 桃紅四物湯對大鼠骨組織病理結構的影響

空白組和假手術組的骨皮質和骨干連續未斷，可見充滿骨髓的海綿狀骨。灌胃第4 天，模型組可見不連續的骨皮質和骨干以及局部壞死的骨組織；原方水提組和單體成分組中均可以見到少量的軟骨細胞和肉芽組織。灌胃第7 天，模型組、原方水體組、單體成分組中均可見大量軟骨細胞和肉芽組織，此外，原方水提組還可見少許骨小梁，單體成分組還可見少許的骨小梁和骨髓腔。 灌胃第10 天，模型組可見大量的軟骨細胞和肉芽組織，未見骨痂；原方水提組和單體成分組均可見少許骨痂，骨痂內有新生骨小梁且排列致密。 見圖2。

表4 大鼠術后BV/TV%變化（n=4，±s）

表4 大鼠術后BV/TV%變化（n=4，±s）

注：與模型組組比較，▲P＜0.05

組別模型組原方水提組單體成分組灌胃第4 天0.21±0.04 0.33±0.06▲0.36±0.05▲灌胃第7 天0.24±0.05 0.47±0.02▲0.42±0.07▲灌胃第10 天0.35±0.06 0.58±0.09▲0.59±0.08▲

圖1 術后第4、7、10 天大鼠股骨顯微Micro-CT 圖像

圖2 術后第4、7、10 天大鼠股骨切片（HE，×40）

4 討論

骨折愈合是一個復雜的過程，是通過細胞、生長因子和生物途徑之間的相互作用來協調的[7]，通過骨折部位處募集祖細胞，促進形成初始軟骨痂，然后被血管再吸收、骨形成和骨化最終達到骨折愈合[8]。骨折修復失敗一直是困擾骨科醫生的重要難題[9]，中醫藥治療骨傷科疾病有著獨特優勢，尤其在治療骨損修復方面，一直是臨床骨科研究的重要領域[10]。現代藥理研究表明[11]，桃仁中的有效成分苦杏仁苷能發揮抗炎作用，其機制可能與通過脂蛋白刺激小鼠小膠質細胞BV-2 中環氧合酶2，并促進一氧化氮合酶mRNA 的表達有關。 紅花中的有效成分羥基紅花黃色素A，能拮抗二磷酸腺苷的促血小板聚集作用[12]，通過競爭性抑制血小板激活因子，正向調控VEGF 的表達，進一步促進血管的新生。 桃紅四物湯含有大量多糖成分，有助于增加造血微循環中的白細胞、紅細胞和血小板的含量，還能刺激肌組織中的造血調控因子，提高外周血中白細胞含量[13-14]。研究表明[15]，阿魏酸具有抗炎、抗血栓、抗氧化、抑制血小板聚集等藥理作用。 芍藥苷能夠抗炎止痛、擴張血管、增加血流量、抑制血小板聚集。川芎嗪具有明顯的抗氧化損傷的作用，能增加組織中的毛細血管數，改善微血管內血液流變性，改善損傷組織血運狀態，加速骨折愈合。梓醇溶液能顯著促進成骨細胞增殖。通過實驗也證實了桃紅四物湯單體成分配伍加速了骨折愈合[16]。

VEGF 在內皮細胞活化、增殖、遷移、改善血管通透性等過程中均起重要作用。血管生成是成骨過程中的關鍵環節，VEGF 又是調控血管發育和血管生成的重要生長因子之一。因此，調控VEGF 表達是修復骨損傷和促進骨再生的重要靶點之一。 本實驗研究發現，與模型組相比，原方水提組與單體成分組VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天均顯著升高；與原方水提組相比，單體成分組VEGF 濃度在灌胃第4、7、10 天未見明顯差別。證實了桃紅四物湯有效單體成分組方可以促進VEGF 的表達。

BV/TV%及BV 是評價骨折斷端生長情況的標志[17]。分析Micro-CT 結果發現，桃紅四物湯單體成分組方能有效促進大鼠早期骨折愈合。骨組織病理學檢測也進一步證實了這一結果，通過觀察灌胃第4、7、10 天病理切片我們發現，原方水提組和單體成分組大鼠軟骨細胞的生長、骨小梁與骨髓腔的形成、骨折愈合的速度均快于模型組。

綜上所述，通過對大鼠一般情況、肢體腫脹度、血清VEGF 濃度、Micro-CT 和組織病理切片的觀察、檢測和分析，本次實驗有效證實了桃紅四物湯單體成分配伍有助于促進大鼠骨折早期愈合，但具體機制尚需進一步研究。 此外，本實驗僅對3個時間點的結果進行分析，樣本量較小，桃紅四物湯單體成分組方是否可以完全替代原方水煎劑還需進一步實驗研究。