益氣解毒方對2Gy 60Coγ 射線誘導的雄性小鼠生精功能損傷的防護作用

陳曉瑩，何昶昊，張曉萌，王 磊，石中玉，葛東宇，董瑞娟，閆 玥，葉一帆，胡素敏*

（北京中醫藥大學中醫學院，北京100029）

電離輻射（ionizing radiation, IR）廣泛存在于自然界中，是一切能夠引起物質發生電離的輻射總稱[1]。機體中的細胞對輻射的敏感性與其更新速率密切相關，即不斷分裂、更新的細胞輻射敏感性越高，受到的損傷越重[2]125。 而作為精子發生、性激素合成的重要性腺器官，睪丸中的生精細胞增殖分化活躍，其對電離輻射也十分敏感[3]。 課題組前期基于“未病先防”的治未病理論，采用預防性給藥的方式，觀察小鼠受照射后7 d 內[4]及第21 天[5]睪丸的動態損傷情況以及高、中劑量益氣解毒方的防護作用，結果表明預防性給藥能夠在照射后短期（7 d 內）有效改善小鼠睪丸形態結構及生精功能的損傷。 若照射后不予治療，后期（21 d 內）睪丸的進行性損傷則無法得到快速修復。 因此，為了進一步探究益氣解毒方對電離輻射致雄性小鼠生殖系統損傷的防治作用，本研究在前期實驗的基礎上，采用預防加治療的給藥方式，增設了益氣解毒方低劑量組，觀察照射后35 d（小鼠的生精周期[2]239）小鼠睪丸損傷情況以及3 個不同濃度組益氣解毒方的全面防護效應，即預防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性BALB/c 小鼠60 只，體質量為（20±2） g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2016-0011。 小鼠均飼養于北京中醫藥大學SPF 級實驗動物房，環境溫度為（23±2） ℃，濕度為40%～60%，交替光照12 h/12 h 模擬晝夜時間，小鼠自由攝食飲水。本實驗研究由北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審核通過，倫理審查編號為BUCM-4-2020091104-3044。

1.2 試劑及儀器

37%～40%甲醛（226396）、冰醋酸（B0801001）、乙醇（BH100223），均購自北京虹湖聯合化工產品有限公司；蘇木素染色液（ZLI-9610）、伊紅染色液（ZLI-9613）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Tissue-Tek TEC5 組織包埋機（日本櫻花檢驗儀器 株 式 會 社）；Leica RM2235 組 織 切 片 機、Leica DM4 B 自動化智能型正置研究級顯微鏡（德國Leica 公司）；Sysmex XS-800i 全自動血液分析儀（日本Sysmex 公司）。

1.3 藥品及制備

益氣解毒方由當歸、生黃芪、淫羊藿、枸杞子、西洋參等中藥組成（該方正在申請專利），以上中藥飲片均購自北京同仁堂（藍色港灣店），經北京中醫藥大學中醫學院中藥教研室李偉老師鑒定后制成復方水煎液。 該復方藥液制備參考本課題組前期方法[6]，復方飲片經過浸泡、二次煎煮、濃縮、醇沉過夜（置于4 ℃冰箱中）、抽濾、回收乙醇，制成益氣解毒方原液，濃度為1.657 g/mL，即為本實驗中益氣解毒方高劑量（2 倍人體等效劑量），將部分原液稀釋成中劑量0.829 g/mL（人體等效劑量）和低劑量0.415 g/mL（0.5 倍人體等效劑量）。

本實驗選取安多霖(1809023，北京中日友好醫院)作為陽性藥，取安多霖膠囊中的藥粉，溶解于相應體積的去離子水中，制成0.027 g/mL 的安多霖藥液（人體等效劑量）。

1.4 小鼠睪丸急性輻射損傷模型制備

采用照射劑量為2 Gy，劑量率為1 Gy/min 的60Co γ 射線（由北京大學化學與分子工程學院鈷源室提供鈷源）對小鼠進行一次性全身照射，復制睪丸急性輻射損傷模型[7]。

1.5 動物分組及給藥

適應性喂養3 d 后，根據體質量隨機將60 只小鼠分為空白組（normal control group, NC 組）、 模型組（irradiationgroup, IR 組）、安多霖組（irradiation+anduolin group, IRA 組）， 以及益氣解毒方高（irradia tion+YQJD high-dose group, IRYH 組）、中（irradiation+YQJD middle-dose group, IRYM 組）、低劑量組（irradiation+YQJD low-dose group, IRYL 組），每組10 只。照射前第7 天(-7 d)，各組小鼠預防性給水/藥干預：NC 組和IR 組每日以去離子水灌胃；IRA 組每日以安多霖藥液灌胃；IRYH 組、IRYM 組以及IRYL 組每日分別以相應濃度水煎液灌胃，灌胃體積均為0.02 mL/g 體質量，每日1 次，共7 d。 之后，除NC 組外，其余各組小鼠用“1.4”造模方法復制睪丸急性輻射損傷模型。于照射后第4 天開始治療性給水/藥干預，方式及劑量同前，持續至照射后第34 天，然后禁食不禁水12 h，于次日即照射后第35 天取材檢測。

1.6 指標檢測與方法

1.6.1 體質量測定 小鼠適應性喂養3 d 后，分別于照射前第7 天（-7 d）、照射當天（0 d）、照射后第4、15、35 天（4、15、35 d），稱取并記錄小鼠的體質量。1.6.2 全血細胞計數 照射后第35 天，采用眼球取血法取小鼠全血100 μL，用EDTA -K2 抗凝，于全自動血液分析儀檢測紅細胞（RBC）、血小板（PLT）、白細胞（WBC）、淋巴細胞（LYMP）以及中性粒細胞（NEUT）。

1.6.3 睪丸、附睪質量測定 小鼠摘眼球取血后，脫頸椎處死，取雙側睪丸、附睪，分別稱取質量。

1.6.4 HE 染色 取單側睪丸及附睪置于改良Davidson's 固定液[8]中（37%～40%甲醛溶液∶無水乙醇∶冰醋酸∶去離子水=6∶3∶1∶10）。 24 h 后，將固定液換成10%的中性甲醛溶液。 酒精梯度脫水后用石蠟包埋，取蠟塊4 μm 連續切片，切片按照HE 染色常規方法進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇下行復水、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、自來水沖洗，伊紅復染后，梯度乙醇上行脫水及二甲苯透明。中性樹膠封片后，于光學顯微鏡下觀察睪丸、附睪的組織形態。

1.6.5 睪丸生精上皮厚度半定量分析 將制備好的睪丸HE 染色切片置于光學顯微鏡視野（×400）下，攝取照片。觀察其組織細胞的結構形態，通過Image-ProPlus 軟件測量生精上皮的厚度（從基底膜到管腔），記錄并分析統計。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 照射前后各組小鼠體質量變化

照射前各組體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。小鼠受照射后，IR 組與NC 組比較，照射后第4、15 天體質量均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。 照射后第4 天，與NC 組比較，IRA 組和IRYM 組、IRYL組體質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），IRYH 組體質量顯著下降(P＜0.01)；與IR 組比較，IRA 組體質量明顯升高（P＜0.05）；與IRA 組及IRYM 組比較，IRYH 組體質量明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），其余各給藥組間體質量無明顯差異（P＞0.05）。 照射后第15天，各照射組體質量均明顯低于NC 組（P＜0.01，P＜0.05），各照射組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。照射后第35 天，各組體質量差異均無統計學意義（P＞0.05）。 結果見表1。

2.2 照射后第35 天各組小鼠全血細胞計數變化

照射后第35 天，IR 組WBC、NEUT 以及RBC、PLT 均低于NC 組，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組的WBC、LYMP、NEUT 以及RBC 與NC 組比較差異無統計學意義（P＞0.05），而PLT 仍明顯低于NC 組（P＜0.01，P＜0.05）。 與IR 組比較，IRA組WBC 及RBC 明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；IRYH組小鼠WBC、LYMP 和RBC 均明顯升高（均為P＜0.05）；IRYM 組LYMP、RBC 和PLT 均明顯升高（P＜0.05）；與IRA 組比較，IRYL 組的RBC 仍下降明顯（P＜0.05），益氣解毒方各組PLT 明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。結果見表2。

表1 照射前后各組小鼠體質量（g，±s，n=8）

表1 照射前后各組小鼠體質量（g，±s，n=8）

注: 與NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05；與IRA 組比較，△△P＜0.01；與IRYM 組比較，▲P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值-7 d 20.45±1.94 21.25±1.15 21.37±0.92 21.52±0.78 20.99±0.95 20.72±0.59 0.280 0 d 21.98±0.38 22.09±0.33 22.41±0.62 21.50±1.20 22.10±0.76 22.05±0.63 0.606 4 d 22.49±0.86 21.45±0.20*22.46±0.85#20.81±1.50**△△▲21.62±0.40 21.38±0.60 0.009 15 d 24.78±0.77 23.06±0.09**23.68±0.39*23.56±0.75**23.60±0.66*23.44±0.73**0.017 35 d 24.57±0.88 24.32±0.74 24.66±1.09 23.70±0.68 24.33±1.04 23.75±1.25 0.238

表2 照射后第35 天各組小鼠全血細胞計數（±s，n=8）

表2 照射后第35 天各組小鼠全血細胞計數（±s，n=8）

注: 與NC 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與IRA 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值WBC/(×109·L-1)3.45±0.52 2.53±0.22*3.46±0.63#3.70±0.65#3.94±1.52 2.80±0.39 0.007 LYMP/(×109·L-1)2.82±0.60 2.05±0.03 2.60±0.21 2.84±0.43#3.53±1.42#2.45±0.30 0.025 NEUT/(×109·L-1)0.065±0.019 0.038±0.020*0.052±0.008 0.030±0.000 0.048±0.015 0.035±0.014 0.035 RBC/(×1012·L-1)10.72±0.20 10.23±0.24**10.75±0.31##10.55±0.37#10.60±0.26#10.46±0.09△0.006 PLT/(×109·L-1)821.71±80.75 502.83±41.38**468.60±23.51**623.86±94.04*△597.88±46.80**#△△609.33±65.45**△0.000

2.3 照射后第35 天各組小鼠睪丸及附睪質量

照射后第35 天，與NC 組比較，各照射組小鼠睪丸、附睪質量均降低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；與IR 組比較，IRA 組、IRYM 組睪丸質量均明顯升高（P＜0.05），其他給藥組睪丸、附睪質量差異均無統計學意義（P＞0.05）。 結果見表3。

表3 照射后第35 天各組小鼠睪丸、附睪質量（g，±s，n=8）

表3 照射后第35 天各組小鼠睪丸、附睪質量（g，±s，n=8）

注: 與NC 組比較，**P＜0.01；與IR 組比較，#P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值睪丸質量0.193±0.008 0.130±0.009**0.141±0.007**#0.132±0.016**0.141±0.005**#0.133±0.006**0.000附睪質量0.063±0.008 0.049±0.009**0.055±0.003**0.049±0.004**0.052±0.003**0.051±0.002**0.000

2.4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度

與NC 組比較，IR 組、IRYL 組生精上皮明顯變?。≒＜0.01，P＜0.05）；與IR 組比較，各給藥組生精上皮厚度均恢復，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；與IRYM 組比較，IRYL 組生精上皮厚度恢復較慢，差異無統計學意義（P＞0.05）。 結果見表4。

表4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度（±s，n=50）

表4 照射后第35 天各組小鼠睪丸生精上皮厚度（±s，n=50）

注:與NC 組比較，**P＜0.01；與IR 組比較，##P＜0.01；與IRYM 組比較，▲P＜0.05

組別NC 組IR 組IRA 組IRYH 組IRYM 組IRYL 組P 值生精上皮厚度/μm 68.07±9.32 26.00±9.22**62.30±3.82##63.59±5.18##68.84±7.68##59.46±9.30*##▲0.000

2.5 照射后第35 天各組小鼠睪丸形態結構

NC 組生精小管結構完好，界膜完整；生精上皮結構清晰，各級生精細胞沿基底面向管腔面有序排列，排列緊湊，層次分明，胞核清晰，胞質豐富，形態結構完整；在生精小管的近管腔面可見大量圓形精子細胞及長形精子。與NC 組比較，IR 組睪丸嚴重損傷，其生精小管萎縮變細變形，且生精細胞層數顯著減少、生精細胞數量顯著降低，但是仍可見精原細胞和少量精母細胞；近腔面無長形和圓形精子。 與IR 組比較，IRA 組、IRYM 組損傷程度明顯改善，生精上皮層數及生精細胞數量明顯增多，可見精原細胞和大量精母細胞，生精小管的管腔中可見到少許精子細胞和長形精子。IRYH 組、IRYL 組生精小管較IR 組稍有恢復，而較IRA 組、IRYM 組恢復較慢。結果見圖1。

2.6 照射后第35 天各組小鼠附睪形態結構

NC 組小鼠附睪上皮細胞排列整齊，細胞結構完整，排列有序，附睪管結構清晰，管腔規則，且腔內可見大量成熟精子。與NC 組比較，IR 組小鼠附睪管腔中精子數量顯著下降，腔內已無長形或圓形精子，且附睪上皮有部分基細胞脫落，管腔內空泡化變性明顯。與IR 組比較，IRYM 組附睪上皮基細胞無明顯脫落，管腔內可見較多的未成熟的圓形精子以及長形精子，且管腔內空泡化變性顯著改善；IRA組、IRYH 組、IRYL 組小鼠精子數量恢復較慢，附睪上皮細胞中基細胞少量脫落，管腔中仍可見少量空泡。 結果見圖2。

3 討論

電離輻射導致的機體損傷是一種涉及多組織器官及多機制之間相互作用的復雜生物學過程。 而體質量是輻射后綜合反映小鼠全身損傷情況以及益氣解毒方防護作用的重要指標。 照射后第4、15 天模型組小鼠體質量顯著下降，結合前期研究結果[9]分析，其與小鼠腸道的損傷密切相關。 而本實驗中益氣解毒方延緩了小鼠體質量的下降速度，起到了較好的輻射防護作用。而后因為其能夠減輕腸道急性損傷程度并促進其在短期內快速修復[10]，縮短了小鼠體質量恢復時間。

圖1 照射后35 天各組小鼠睪丸形態結構（HE，×400）

圖2 照射后35 天各組小鼠附睪形態結構（HE，×400）

機體內不同組織器官的輻射敏感性不同，受照射后，損傷程度及恢復時間不同。小鼠腸道急性輻射損傷能夠在短期內快速修復，促進了小鼠體質量的恢復。 然而，部分較敏感的組織器官仍未能得到及時地修復，如造血系統和生殖系統。

造血系統對射線高度敏感，受照射后骨髓造血功能低下，導致血細胞數量明顯下降。 照射后第35天，模型組小鼠全血計數顯著低下，而益氣解毒方高、中劑量組，尤其中劑量組的全血計數明顯改善，結合前期研究結果[11]，該方在預防給藥階段減輕了射線對造血系統的損傷；后期的治療給藥則促進了全血中各項指標的恢復，從而發揮了輻射防護作用。

電離輻射對生殖系統的作用主要表現為其對性腺器官的影響[2]239。 睪丸是雄性重要的性腺器官，兼顧生殖及內分泌功能，輻射敏感性較高[12]。睪丸中富含高度彎曲的生精小管，其占睪丸總體積的98%[13]。輻射后生精小管萎縮變細，這可能是導致睪丸質量減輕的重要因素。生精小管是由生精上皮構成的上皮性管道。生精上皮上的生精細胞增殖分化較活躍，對電離輻射高度敏感。睪丸HE 染色切片顯示，模型組小鼠生精上皮層數以及生精細胞顯著減少，生精上皮厚度變薄。這是因為電離輻射后，各級生精細胞出現不同程度的變性壞死；同時，精原細胞嚴重損傷后未能及時補充壞死脫落的生精細胞，加劇了生精上皮的損傷。而益氣解毒方中劑量組能夠明顯改善生精細胞增殖分化以及生精小管損傷情況，促進了生精上皮的再生，有助于睪丸質量、組織形態及生精功能的恢復。

精子分化程度較高，有相對的放射抗性[14]。照射后第35 天，附睪管中精子數降低，這是由于生精細胞嚴重壞死脫落，精子分化無源。附睪是貯存精子，并使精子獲得運動力的重要場所。 附睪HE 切片中顯示附睪管上皮有部分基細胞脫落，腔液呈空泡化變性，這些改變會影響附睪上皮的分泌和重吸收功能，破壞精子成熟和儲存的內環境[15]。而益氣解毒方能促進生精功能的恢復，同時又能促進附睪管上皮和腔液的修復，減少精子數下降。

綜上，預防加治療性給予益氣解毒方能夠促進輻射后小鼠全血細胞數量恢復，有助于生精上皮的再生，改善生精功能，且該方中劑量對小鼠睪丸組織形態和生精功能的防護作用效果更優。