Polycomb蛋白SUZ12在肝細胞癌組織中的表達及與預后的關系

鄭唐輝 薛同春

（1 復旦大學附屬中山醫院廈門醫院肝腫瘤內科，福建 廈門 361015；2 復旦大學附屬中山醫院肝腫瘤內科，上海 200032）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是高致死性的惡性腫瘤之一，其在全球腫瘤致死性病因中排名第4位[1]。目前盡管有外科切除、介入、化療、口服靶向藥物、免疫抑制劑等治療方法，但由于對肝癌的發生、發展機制仍不十分明確，使其5年總體生存率仍不到20%[2]。因此，探索潛在的促癌基因靶點對指導HCC的臨床治療具有顯著必要性。

多梳蛋白SUZ12（suppressor of zeste 12）是由人類SUZ12 基因所編碼的蛋白質，近年來該編碼基因備受關注。正常情況下，SUZ12基因與EED基因（embryonic ectoderm development）及EZH1/2基因（enhancer of zeste homolog 1 or 2）協同參與染色質形成、基因表達及干細胞分化等，該作用貫穿于果蠅到人類等物種的全生命周期[3]。目前，已發現SUZ12的異常表達與多種惡性腫瘤的發生、發展及臨床預后密切相關[4-5]，然而在原發性肝癌中的研究仍缺乏足夠的報道。本研究應用免疫組織化學的方法檢測SUZ12蛋白在HCC中的表達情況，著重探索其與原發性肝癌患者的臨床預后關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 由復旦大學附屬中山醫院隨機提供于2007年11月至2008年6月手術切除的肝血管瘤正常肝組織27例，原發性肝癌標本88例及相應的癌旁組織。肝癌患者中，其中男性71例，女性17例；年齡24～79歲，平均年齡（53.47±6.52）歲；臨床病例分期按美國聯合癌癥委員會（AJCC）法：Ⅰ期42例，Ⅱ期20例，Ⅲ期26例，Ⅳ期0例。所有患者術前均無肝外遠處轉移、放療、化療或其他輔助性治療。全部標本均經病理證實為HCC，并用10%福爾馬林固定、常規石蠟包埋。

1.2 主要試劑 兔抗人SUZ12單克隆抗體購買自美國Proteintech公司。工作溶度按1∶40的體積溶度進行稀釋；山羊抗兔免疫組織化學染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、一抗稀釋液、檸檬酸緩沖液（抗原修復液）、PBS、蓋玻片均購自上海生物科技公司。其余實驗器材和常規試劑均為實驗室統一配制。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制備 含有88例人HCC，27例正常肝組織。組織芯片由復旦大學附屬中山醫院病理科按科室建立的技術平臺制備，組織芯片直徑1.0 mm，石蠟切片厚5 μm。

1.3.2 免疫組織化學檢測 組織芯片常規脫蠟、水化，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=6.0）微波抗原修復，0.3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉。兔抗人SUZ12抗體按1∶40稀釋后作為第一抗，山羊抗兔抗體作為第二抗進行免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精對比染色。最后常規脫水、透明、干燥、封片、鏡檢、拍照。

1.3.3 結果判定 由Pannoramic MIDI掃描儀（3D HISTECH公司）對組織芯片進行圖像采集，應用配套軟件densito quant自動分析出強陽性、陽性、弱陽性及陰性的面積（單位：像素）、陽性的百分比，并自動計算H-score評分。其中H-Score=0～1為陰性及1～50分為弱陽性（低表達組）；51～100分為陽性及101～300分為強陽性（高表達組），上限為300分。

1.4 隨訪 所有患者術后均進行定期隨訪，隨訪時間為患者接受手術的時間，隨訪截止時間為2015年7月1日。采用門診隨訪及電話隨訪結合的方式，平均每3個月隨訪1次。對死亡患者其死亡時間即為終止時間。中途失訪2例，其終止時間為最后1次隨訪時間，中途失訪患者亦納入生存分析。

1.5 統計學分析 數據采用SPSS20.0統計軟件，SUZ12的表達于臨床病理學數據的相關性用Chi-square檢驗或Fisher檢驗，組間差異分析用t檢驗，Kaplan-Meier生存分析用Log-rank檢驗；單因素及多因素生存分析用Cox回歸分析檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SUZ12的表達情況 免疫組織化學檢測發現在本研究中的SUZ12在肝癌組織和正常組織中的表達陽性率分別為89.24%和56.65%。其中肝癌組織中低表達30例（34.09%），高表達58例（65.91%）；正常組織均為低表達。PBS染色均未發現特殊染色（圖1）。

圖1 SUZ12在肝癌組織中的表達情況（×400）

2.2 SUZ12的表達與肝癌臨床病理因素的關系 Chi-square及Fisher檢驗發現SUZ12高表達與肝硬化存在負相關（P=0.043），且與HBsAg攜帶狀態（P=0.089）存在正相關趨勢，而與患者的性別（P=0.209）、年齡（P=0.541）、甲胎蛋白（P=0.134）、腫瘤大小（P=0.306）、腫瘤數目（P=0.832）、血管侵犯（P=0.759）、分化程度（P=0.728）、AJCC（P=0.557）差異無統計學意義（表1）。

2.3 生存分析

2.3.1 Kaplan-Meier生存分析 對88例肝癌患者術后的生存資料進行Kaplan-Meier生存分析顯示：SUZ12低表達者的平均生存時間為75.70個月，中位生存時間為106.00個月；高表達者的平均生存時間為50.50個月，中位生存時間為26.00個月。隨著SUZ12標的升高，患者的生存時間明顯下降，差異具有統計學意義（χ2=5.212，P=0.022）（圖2）。

2.3.2 Cox回歸分析 對所有與臨床病理指標進行單因素Cox回歸分析，將其影響生存率的因素再進行多因素回歸分析。統計結果顯示：SUZ12高表達是肝癌患者生存的危險因素，SUZ12陽性表達可以作為肝癌患者的生存預測因子（P=0.009）。并且腫瘤＞5 cm（P=0.020）、低分化（P=0.037）及AJCC分期（P＜0.001）也是肝癌患者獨立的不良生存預測因子（表2、3）。

3 討 論

近年來，盡管索拉菲尼、侖伐替尼等抑制血管生成靶向藥物以及PD-1、PD-L1、CTL-A4等免疫抑制劑的臨床應用，使得肝癌的5年生存率有所提高，但療效仍十分有限[6]。這主要是由于惡性腫瘤隨著時間推移多數都會發生復發及轉移，最終將患者推向終末階段。SUZ12基因高度保守，廣泛存在于從果蠅到包含人類的多種哺乳動物中，在維持染色質結構、調控細胞生命周期、引導干細胞分化、促進胚胎發育等方面有著決定性的作用[7]。目前已有研究發現，SUZ12基因的異常表達可直接或間接參與腫瘤的發生、發展。Hu 等[8]發現，乳腺癌患者若出現TRPS1缺失，則可增強SUZ12的表達活性并進一步促進腫瘤的復發轉移。

表1 肝癌組織中SUZ12的表達與臨床病例特征的關系（例）

圖2 SUZ12高表達組與低表達組Kaplan-Meier生存分析

SUZ12在肝癌中的相關研究大部分仍局限于動物模型或肝癌細胞株，且存在一定的爭議。Kirmizis等[9]曾在早期發現，SUZ12在小鼠肝癌模型中的mRNA水平較對照組明顯升高，并推測SUZ12是治療惡性腫瘤的潛在靶點。Liu 等[10]進一步確認SUZ12蛋白在多種肝癌細胞癌株中不同程度的表達上調，并通過EZH2/PAK6信號通路協同促進肝癌的增殖、遷移和侵襲。上述關于SUZ12在肝細胞中的表達水平與本研究結果比較一致。本研究通過免疫組織化學檢測發現，SUZ12在HCC患者中的表達水平顯著高于正常肝組織。表明SUZ12的異常高表達可能參與了HCC的發生、發展。進一步的生存分析發現，SUZ12的表達升高可顯著降低肝癌患者的預期生存時間，多因素分析提示SUZ12是肝癌患者獨立的預測生存因子。2019年，Xue 等[11]的研究顯示SUZ12在乙型肝炎相關性肝細胞中表現為高表達，該結果與本研究有所差異。推測SUZ12在肝癌的不同發展階段可能有不同的表現。本研究結果提示，SUZ12的表達隨著AJCC分期越晚，其表達水平越高。目前已知原發性肝癌是一種高度異質性惡性腫瘤，其體積大小、血管侵犯、細胞分化等都可能與SUZ12內在互相調控機制相關。本研究內容仍存在一定的局限性，關于SUZ12在HCC發生、發展中的作用機制仍需要進一步探討，如SUZ12在肝癌遠處轉移中是否起潛在調控作用等問題仍需更多的臨床資料及試驗研究進一步驗證。

表2 Cox單因素模型參數估計

表3 Cox多因素模型參數估計

綜上所述，SUZ12蛋白在HCC中具有較高的表達率，其可能參與了肝癌的發生、發展，并且SUZ12蛋白的表達水平可作為判斷肝癌患者預后的潛在指標。