癌癥疼痛基因的生物信息學(xué)分析及其臨床意義

葛燕燕 陸 進(jìn) 梁啟勝*

（1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 蚌埠 233000；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233000）

癌癥是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，并且隨著人類居住環(huán)境的改變、食品安全問題的出現(xiàn)和現(xiàn)代化檢測方法的進(jìn)一步發(fā)展，其發(fā)病率和病死率呈逐年增長的趨勢[1]。癌癥不僅給患者家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，浪費(fèi)社會醫(yī)療資源，同時(shí)也對患者個(gè)體帶來機(jī)體上的痛苦。癌性疼痛是由于癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等因素所引起的機(jī)體疼痛感，簡稱癌痛。癌癥的發(fā)生被證實(shí)與癌基因有關(guān)，并且伴隨患者機(jī)體疼痛[2-3]，其中30%～50%患者的癌痛發(fā)生在早中期，而75%～90%晚期癌癥患者經(jīng)常受癌痛折磨[4]。雖然有研究者證實(shí)采用有效的治療可使70%～90%的癌痛患者得到一定程度的緩解。然而，尚有約30%的癌癥患者的嚴(yán)重疼痛得不到有效治療[5]。其中癌癥患者晚期發(fā)生的復(fù)雜性疼痛是導(dǎo)致疼痛得不到控制的重要因素。因此，研究癌癥患者復(fù)雜性疼痛相關(guān)的基因，為靶向藥物的研制提供依據(jù)，對減少癌癥患者的疼痛和提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 研究所用復(fù)雜性疼痛基因芯片數(shù)據(jù)GSE47603(復(fù)雜疼痛樣本4例，健康樣本5名)從高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫下載。樣本詳細(xì)信息見表1和圖1。

表1 樣本基本信息

圖1 病例樣本的整齊性和區(qū)分度

1.2 方法

1.2.1 利用BART（http://igc1.salk.edu:3838/bart/）數(shù)據(jù)庫繪制GSE47603數(shù)據(jù)的火山圖和熱圖。

1.2.2 利用GEO2R（可對GEO中數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析）在線工具對GSE47603數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析并下載整理數(shù)據(jù)，再按照P＜0.05且|logFC|≥1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。

1.2.3 利用Metascape數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2.4 利用基因、蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系檢索工具（search tool for the retrival of interacting genes/proteins，String）(https://string-db.org/)在線分析差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。再利用Cytoscape軟件CytoHubba插件的MCC（McCreight）算法，獲取得分最高的前10個(gè)基因（關(guān)鍵基因）。

1.2.5 利用Oncomine（https://www.oncomine.org/resource/login.html）數(shù)據(jù)庫對篩選出得分＞5的基因（關(guān)鍵基因）在人類常見腫瘤類型中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。檢索條件為P＜0.05且|logFC|≥2。

2 結(jié)果

2.1 GSE47603數(shù)據(jù)分析 通過BART數(shù)據(jù)庫分析GSE47603數(shù)據(jù)得到相應(yīng)的火山圖和熱圖，再通過GEO2R在線分析工具對GSE47603數(shù)據(jù)下載并處理，共得到37個(gè)差異基因，其中表達(dá)下調(diào)的基因4個(gè)，表達(dá)上調(diào)的基因33個(gè)。見圖2。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對37個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因的GO功能主要富集在細(xì)胞因子介導(dǎo)、細(xì)胞對γ干擾素反應(yīng)、對外部刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、整合素介導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成、蛋白質(zhì)泛素化、調(diào)節(jié)性胞分泌等上。KEGG主要富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用通路、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-7信號通路和造血細(xì)胞調(diào)節(jié)等通路。見圖3。

圖2 火山圖和熱圖

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析和關(guān)鍵基因篩選 利用String 在線分析工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)，再利用Cytoscape軟件CytoHubba插件的MCC算法進(jìn)行基因篩選，得到得分排名居前10位的關(guān)鍵基因分別是非肌性肌球蛋白重鏈9基因（non-musclemyosinheavychain9，MYH9）、CXC趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）8（IL8）、輔肌動蛋白（Actinin，ACTN）1、斑聯(lián)蛋白（Zyxin，ZYX）、踝蛋白（Talin，TLN）1、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9、轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）2、腫瘤抑制因子M（OncostatinM，OSM）、IL17RA、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DQB（DQ beta）1。見圖5和表2。

2.4 關(guān)鍵基因在各類型腫瘤中的表達(dá)情況 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對得分＞5分的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示關(guān)鍵基因在各類型腫瘤中均有所表達(dá)。見圖6。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

圖5 關(guān)鍵基因篩選圖

表2 關(guān)鍵基因得分排名情況

圖6 關(guān)鍵基因在各類型腫瘤中的表達(dá)情況

3 討論

隨著人口老齡化的逐漸增長，癌癥的發(fā)生率也在逐年增加，并且導(dǎo)致較高的病死率，嚴(yán)重威脅人類的生命安全。然而，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和醫(yī)療技術(shù)水平的發(fā)展，使癌癥患者的生存時(shí)間得到大幅延長[6]。但是，癌癥引起的復(fù)雜性疼痛也長期伴隨患者，已成為一種嚴(yán)重的社會問題。國際疼痛研究學(xué)會已明確疼痛是繼血壓、脈搏、呼吸、體溫之后的第五生命指征，癌痛作為癌癥患者的長期癥狀，已經(jīng)在生理、心理、精神和社會等方面影響患者及其家庭成員的生活質(zhì)量[7]。因此，研究癌痛相關(guān)基因具有重要的臨床意義。

本研究利用最新的生物信息學(xué)結(jié)合腫瘤大數(shù)據(jù)分析方法對從GEO數(shù)據(jù)庫下載的GSE47603芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行GO功能注釋、KEGG通路富集、PPI網(wǎng)絡(luò)圖、關(guān)鍵基因篩選、關(guān)鍵基因確定和Oncomine數(shù)據(jù)庫分析。

通過對GSE47603芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到37個(gè)差異表達(dá)基因，進(jìn)一步對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)其功能主要富集在細(xì)胞因子介導(dǎo)、細(xì)胞對γ干擾素反應(yīng)、對外部刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、整合素介導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成、蛋白質(zhì)泛素化、調(diào)節(jié)性胞分泌等上，這些GO功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)細(xì)胞功能密切相關(guān)。其中，細(xì)胞因子介導(dǎo)和干擾素功能已被證明與疼痛密切相關(guān)[8-11]。此外，有研究者經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成功能也與疼痛密切相關(guān)[12-13]。因此，這些差異表達(dá)基因的本體功能與患者的疼痛明顯相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用通路、IL-7信號通路和造血細(xì)胞調(diào)節(jié)等通路上。而細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用通路也被證明與相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[14-15]，而IL-7信號通路與機(jī)體對刺激的反應(yīng)密切相關(guān)[16]。這些分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因的通路與機(jī)體對癌癥和疼痛的反應(yīng)密切相關(guān)。

對37個(gè)疼痛差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析和關(guān)鍵基因篩選得到得分＞5的6個(gè)基因，分別對這6個(gè)基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)基因在人類常見各類型腫瘤中均有一定程度的表達(dá)，并且以高表達(dá)居多，而研究者已證實(shí)有些基因與腫瘤疼痛明顯相關(guān)，并且對腫瘤患者的生存預(yù)后有不良影響[17]。因此，這些疼痛基因可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，通過一種新的大數(shù)據(jù)分析方法得到與癌痛相關(guān)的基因，為腫瘤患者疼痛治療提供了重要的依據(jù)，具有重要的臨床意義。但由于未進(jìn)行相應(yīng)的基礎(chǔ)試驗(yàn)研究，缺乏相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，下一步將以預(yù)測結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)研究和臨床數(shù)據(jù)搜集。