利用高通量測序技術(shù)分析陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人外泌體miRNA表達譜異同

王樂鵬 王婷 霍瑰陽 蔡亞楠 劉文斌 黃光瑞 袁凱

陽虛體質(zhì)是中醫(yī)人體九種體質(zhì)的一種類型。陽虛體質(zhì)人群常常表現(xiàn)出怕冷、容易疲勞、肌肉松軟等陽虛相應(yīng)的特征[1]。外泌體是近年來興起的重要研究領(lǐng)域[2]。2013年的諾貝爾獎表彰了發(fā)現(xiàn)外泌體調(diào)控運輸機制的三位科學(xué)家。外泌體是一種由于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷而造成的囊泡[3]。該囊泡中包含了非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)與RNA。外泌體中的RNA包括mRNA、miRNA、lncRNA以及其他各種非編碼RNA[4]。外泌體參與多種生物學(xué)功能，包括作為介質(zhì)工具傳遞相關(guān)信號，從而實現(xiàn)細胞與細胞之間信息的交流[5]。目前在多種疾病的研究中，均發(fā)現(xiàn)外泌體在疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。如腫瘤的微環(huán)境中，外泌體參與腫瘤的生長、分化、凋亡和轉(zhuǎn)移[6]。除了參與腫瘤發(fā)病，既往研究還發(fā)現(xiàn)外泌體參與的信號調(diào)節(jié)非常廣泛地參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病的病理生理過程[7]。

本研究將中醫(yī)陽虛體質(zhì)與外泌體結(jié)合起來研究，利用高通量測序技術(shù)，分析陽虛體質(zhì)人群外泌體miRNA表達譜。通過對miRNA表達譜的研究，希冀得到外泌體在陽虛體質(zhì)人群中的相應(yīng)作用。為相應(yīng)體質(zhì)人群防病治病得到理論支撐。

1 材料與方法

1.1 血液樣本來源

本研究從北京中醫(yī)藥大學(xué)在校學(xué)生中招募志愿者，共招募陽虛體質(zhì)3名，平和體質(zhì)3名。健康人平和體質(zhì)與陽虛體質(zhì)根據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會2009年實施的《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》來判定，并且接受中醫(yī)專家診斷。所有參與者在進入研究之前均已簽署書面知情同意。參與者無慢性疾病，無心、肝、腎、消化道、呼吸、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病；體格檢查未發(fā)現(xiàn)臨床意義的陽性體征；實驗室檢查未發(fā)現(xiàn)異常。根據(jù)納入標準和排除標準，本研究共納入受試者6名，包括3名陽虛體人，3名平和體質(zhì)人。陽虛體質(zhì)的癥狀特點包括手腳涼、胃脘部背部怕冷、穿衣多、不耐受寒冷、易感冒、冷飲后不適、冷飲后腹瀉等。平和體質(zhì)包括精力充沛、說話有力、睡眠良好、適應(yīng)外界環(huán)境變化等。6名受試者均為北京中醫(yī)藥大學(xué)在校學(xué)生，能夠減少教育程度與年齡等混雜因素影響，從而能夠更好比較陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的差異。本研究抽取每位參與者20 mL外周血。研究對象為循環(huán)外泌體RNA。通過高通量測序?qū)ν饷隗wRNA進行了分析。研究方案獲得北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(KTPJ-BZYSY-2017-01)。

1.2 外泌體提取和定量分析

在本研究中，使用exoEasy Maxi試劑盒(QIAGEN，USA)，根據(jù)制造商的說明從血漿樣品中分離外泌體。此外，外泌體miRNA通過miRNeasy試劑盒(QIAGEN，USA)制備[8]。提取的RNA質(zhì)量與數(shù)量由Agilgent Bioanalyzer 2100鑒定。細胞RNA由RNA 6000 Pico試劑盒檢測分析。

1.3 外泌體RNA測序分析

使用miRNeasy試劑盒用來分離外泌體中所有小RNA。利用Illumina HiSeq 2000平臺對RNA進行測序分析[9]。

1.3.1 RNA測序數(shù)據(jù)處理 利用HISAT2將讀取的數(shù)據(jù)映射到參考數(shù)據(jù)庫CRCh38。使用miRDeep2軟件和RNAfold分析miRNA。miRNA表達量計算采用TPM(transcript per million)計算度量指標，TPM含義是以每百萬比配成對序列做miRNA表達量指標，其中總比配成對 read 數(shù)目用于歸一化表達量數(shù)值。以“P<0.05，倍數(shù)變化>2”為閾值顯著性，確定miRNA差異表達。

1.3.2 miRNA差異火山圖繪制 對不同分組間(樣本間)篩選出來的差異miRNA進行統(tǒng)計。從而比較陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人之間血清外泌體miRNA的異同。將比較所產(chǎn)生的差異情況反映到火山圖中，灰色為非差異miRNA，紅色為上調(diào)顯著差異miRNA，綠色為下調(diào)顯著差異miRNA。

1.3.3 表達模式聚類分析 對差異表達miRNA進行層次聚類。計算多個樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，用挑選的差異miRNA的表達情況來計算樣品直接的相關(guān)性，用熱圖展示。

1.4 差異基因功能富集分析

1.4.1 差異miRNA的靶基因預(yù)測 得到差異miRNA之后，使用miRanda算法預(yù)測差異miRNA的靶向基因。 選擇差異表達的miRNA的MiRanda目標進行功能注釋。

1.4.2 GO分析 GO功能分析是針對全基因/轉(zhuǎn)錄本和差異miRNA靶基因/轉(zhuǎn)錄本進行功能注釋和歸類。將全基因/轉(zhuǎn)錄本作為背景列表，差異miRNA靶基因/轉(zhuǎn)錄本列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，使用 Fisher 算法分別對各比較組差異miRNA預(yù)測的靶基因基因從分子功能(Molecular Function)、細胞成分(Cellular Component)和參與的生物過程(Biological Process)三個方面進行富集分析。

1.4.3 KEGG分析 KEGG功能注釋通路顯著性富集，確定差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異miRNA靶基因進行Pathway分析，并用超幾何分布檢驗的方法計算每個Pathway條目中差異miRNA靶基因富集的顯著性。

1.5 統(tǒng)計分析

本研究使用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。miRNA表達量計算采用TPM(transcriptpermillion)計算度量指標，TPM公式=(每條miRNA比對到的read數(shù)目)/(樣本總比對read數(shù)目)×106。基因表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性使用Pearson相關(guān)系數(shù)進行。P<0.05時，表示其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)血清外泌體miRNA差異表達譜

本研究中，根據(jù)具有TPM倍數(shù)變化>2且表達中P<0.05的差異用來過濾miRNA。得到陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)對比火山圖(見圖1)。經(jīng)過濾分析后，共篩選出28種miRNA。陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人相比上調(diào)的miRNA共有19種，包括hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-3157-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-374a-5p等。陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人相比下調(diào)的miRNA共有9種，包括hsa-miR-409-3p、hsa-miR-625-3p等。此外，利用層次聚類分析(Hierarchical Clustering analysis)得到陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)miRNA的可視化差異(見圖2)。結(jié)果表明，陽虛體質(zhì)人中有19種miRNA表達高于平和體質(zhì)人，9種miRNA表達低于平和體質(zhì)人。

注：陽虛體質(zhì)上調(diào)miRNA為紅色表示。陽虛體質(zhì)下調(diào)miRNA為綠色表示。

2.2 血清外泌體miRNA靶基因的GO分析

得到3例陽虛體質(zhì)人與3例平和體質(zhì)人的差異血清外泌體miRNA后，對陽虛質(zhì)與平和質(zhì)的差異miRNA進行靶基因預(yù)測。利用GO方法，對預(yù)測為差異表達外泌體miRNA靶標的基因進行分析，以期得到組間差異基因的生物過程(Biological Process)、細胞成分(Cellular Component)、分子功能(Molecular Function)三個方面功能。如圖3顯示，相關(guān)的生物學(xué)過程包括DNA模板轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。細胞組分包括細胞核、細胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、核質(zhì)等。分子功能包括蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合、RNA聚合酶II活性等。

圖2 陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)血清外泌體miRNA差異表達譜熱圖

注：綠色代表生物學(xué)過程(GOBP)，藍色代表細胞成分(GOCC)，紅色代表分析功能(GOMF)。

2.3 差異血清外泌體miRNA靶基因的KEGG途徑富集

得到3例陽虛體質(zhì)人與3例平和體質(zhì)人的差異血清外泌體miRNA后，對陽虛質(zhì)與平和質(zhì)的差異miRNA進行靶基因預(yù)測。為了確定針對整個參考基因背景的特定miRNA靶標，使用了預(yù)測為差異表達的外泌體miRNA靶標的基因進行了KEGG富集分析。差異表達的miRNA的靶標主要相關(guān)包括器官系統(tǒng)、代謝、疾病等。在器官系統(tǒng)中，相關(guān)系統(tǒng)包括免疫系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等。代謝中，包括脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝、氨基酸代謝等。相關(guān)疾病中，包括腫瘤、感染性疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、神經(jīng)退行性病變等。基因相關(guān)包括轉(zhuǎn)錄、翻譯等。具體內(nèi)容詳見圖4。

3 討論

中醫(yī)體質(zhì)學(xué)是中醫(yī)學(xué)具有非常鮮明特色的學(xué)科。體質(zhì)現(xiàn)象是人體結(jié)合先天和后天所形成的具有獨特生理與心理特點的特質(zhì)。本研究利用外泌體作為切入點，以期得到陽虛體質(zhì)人群的生物學(xué)基礎(chǔ)，以及陽虛體質(zhì)人群與平和質(zhì)人群的差異，從而更好地為體質(zhì)調(diào)理及防病治病提供理論依據(jù)。

在本研究中，通過比較陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人的miRNA差異，發(fā)現(xiàn)陽虛體質(zhì)人上調(diào)的miRNA包括hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-3157-5p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-374a-5p等。陽虛體質(zhì)人下調(diào)的miRNA包括hsa-miR-409-3p、hsa-miR-625-3p等。在差異miRNA中，許多種類的miRNA如hsa-miR-101-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-19b-3p等均與腫瘤、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。外泌體miRNA參與多種人體生理病理功能調(diào)節(jié)，在免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)，參與激素與抗體的生成與調(diào)節(jié)，從而在腫瘤和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

通過對預(yù)測為差異表達的外泌體miRNA靶標的基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)人群相比，易患疾病包括腫瘤與感染性等疾病。中醫(yī)認為腫瘤的發(fā)生多為體質(zhì)虛寒，陽虛于內(nèi)而氣化不足，導(dǎo)致內(nèi)邪如痰飲、瘀血等積聚成塊而致病[10]。缺乏陽氣運化，濕濁痰飲等邪氣停留體內(nèi)，不能氣化，又與寒邪瘀血等交織在一起，則容易形成各種良性或惡性腫瘤。故中醫(yī)對腫瘤的治療方法就包括宣通陽氣，將陰濁瘀血水飲痰濕等邪氣驅(qū)散，從而達到治療疾病的目的[11]。在感染性疾病中，由于缺乏陽氣顧護，則人體更加容易受到感染性疾病的侵襲。正氣存內(nèi)則邪不可干，一旦人體出現(xiàn)陽氣虛衰、 正氣不足的表現(xiàn)時， 常常會罹患傷寒

注：粉紅色代表器官系統(tǒng)，藍色代表代謝相關(guān)，淺藍色代表人類疾病，綠色代表基因信息傳遞，褐色代表環(huán)境因素傳遞，粉色代表細胞過程。

等傳染性疾病。該研究結(jié)果認為陽虛體質(zhì)人更容易罹患腫瘤和感染性疾病，可以解釋其陽虛體質(zhì)寒邪致病的機理。

此外，陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的差異系統(tǒng)主要在內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)。上海中醫(yī)藥大學(xué)沈自尹院士研究證明，腎陽虛證者存在下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能低下和紊亂，并用現(xiàn)代科學(xué)方法證實其有特定病理基礎(chǔ)[12]。該研究從外泌體miRNA作為切入點，發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)是陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的差異系統(tǒng)。內(nèi)分泌系統(tǒng)中的下丘腦-垂體-腎上腺軸與下丘腦-垂體-甲狀腺軸恰恰反映了中醫(yī)陽氣的概念，腎上腺分泌的腎上腺素與去甲腎上腺素，甲狀腺分泌的甲狀腺，是人體重要的內(nèi)分泌激素[13]。當腎上腺激素或者甲狀腺激素分泌不足時，人體會出現(xiàn)疲倦、嗜睡、精神不振、記憶力減退、四肢冰冷、怕冷、畏寒等典型的陽虛體質(zhì)表現(xiàn)[14]。對于免疫系統(tǒng)，中醫(yī)學(xué)也認為其與陽氣密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認為有陽氣顧護人體，陰寒邪氣難以侵襲入里，傷害人體。而當陽氣不足時，風(fēng)寒濕三邪非常容易侵襲體表，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。

此外，陽虛體質(zhì)人與平和體質(zhì)人的差異基因功能還體現(xiàn)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子與相互作用。在免疫系統(tǒng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)中，有大量的細胞因子參與信號轉(zhuǎn)到，外泌體miRNA也參與細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]。故而能夠體現(xiàn)陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的差異。

綜上，本研究通過研究陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的外泌體miRNA，分析陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)陽虛體質(zhì)與平和體質(zhì)相比的易患疾病，從而為體質(zhì)養(yǎng)生與體質(zhì)調(diào)攝提供理論與實踐依據(jù)。