舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠子宮組織ER、PR、PRLR表達及內膜病理形態的影響

項濤 陳彪 馬文擎 翁艷潔

人工流產是暫無生育要求但意外懷孕女性的唯一補救措施，近年來，其發生率一直呈增加趨勢[1]。臨床上人工終止妊娠方法有手術流產和藥物流產兩種，其中，藥物流產較手術流產使用方便、痛苦小，被廣大婦女接受[2]。然而，盡管臨床醫學技術在不斷進步，藥物流產的安全性與有效性也更有保障，但其弊端及不足仍存在。研究表明，藥物流產可能出現出血量大、出血時間長等副作用，進而可引發子宮內膜炎、盆腔炎等多種疾病，嚴重可導致不孕[3-4]。雌激素、孕激素、催乳素等是維持女性正常內分泌的重要激素，分別通過與靶細胞上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)結合發揮作用，其分泌紊亂會引發子宮內膜的一系列病理變化[5-7]。舒爾經膠囊具有疏肝活血、調經止痛的功效，常用于痛經、月經量少、后錯屬氣滯血瘀證者，近年來發現，其在流產術后子宮內膜修復上具有一定療效[8]。本研究將通過研究舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠子宮組織ER、PR、PRLR表達及內膜病理形態的影響，以期為減少藥物流產副作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠50只，雄性大鼠25只，健康性成熟且未生育，體質量(200±5)g，許可證號：SYXK(魯)2017-0030，購于山東新創生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

舒爾經膠囊(國藥準字Z20025985)購自海南博大制藥廠；宮血寧(國藥準字Z20020087)購自云南白藥集團股份有限公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；ER、PR、PRLR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) mRNA引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；雌激素酶聯免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：K3829-100)購自美國Biovision公司；孕激素ELISA試劑盒(貨號：CSB-E07282r)購自美國Cusabio公司；催乳素ELISA試劑盒、ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(貨號：ab100736、ab3575、ab63605、ab214303、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司；光學顯微鏡(型號：SZ51/SZ61)購自日本Olympus/奧林巴斯；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產品；化學發光成像系統(型號：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 藥物流產大鼠模型制備、分組與給藥

將大鼠于下午5:00按雌雄2∶1合籠交配，次日上午8：00行雌鼠陰道涂片檢查，以檢出精子的當天為妊娠第1天。未檢出精子的雌鼠于下午5:00繼續合籠交配，連續3天，共獲得妊娠大鼠40只。

將40只妊娠大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組和舒爾經膠囊高劑量組，每組8只。模型組、陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組和舒爾經膠囊高劑量組妊娠大鼠于妊娠第7天上午8：00給予米非司酮16.6 mg/kg灌胃1次，于下午18：00給予米索前列醇100 μg/kg灌胃1次，制作大鼠藥物流產模型。

造模成功后次日，空白對照組、模型組給予生理鹽水，陽性對照組給予宮血寧10 mg/kg，舒爾經膠囊低、高劑量組分別給予舒爾經膠囊190 mg/kg、330 mg/kg，每天給藥1次，給藥體積均為1.0 mL/100 g體重，連續7天。

1.4 標本采集

各組大鼠給藥結束后24小時內，給予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，將大鼠處死，分離大鼠子宮。

1.5 蘇木素-伊紅(hematoxylin-Eosin，HE)染色觀察子宮內膜組織病理學變化

子宮組織經10%福爾馬林溶液固定、常規脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡觀察子宮內膜組織病理學變化。子宮所有形態改變根據以下評分標準進行評分：①0分：胚囊完整，絨毛與蛻膜殘留多；②1分：胚囊排出，無絨毛殘留，較多蛻膜組織殘留；③2分：胚囊排出，無絨毛殘留，少量蛻膜組織殘留或子宮內膜修復不好；④3分：胚囊排出，無絨毛殘留，無蛻膜組織殘留，子宮內膜未較好修復；⑤4分：胚囊排出，無絨毛殘留，無蛻膜組織殘留，子宮內膜較好修復。

1.6 ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平

將腹主動脈血4℃ 3000 r/min，離心10分鐘，取上層血清。ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平，試驗方法均按照試劑盒說明書進行，酶標儀測定波長450 nm處吸光度值，計算血清雌激素、孕激素、催乳素水平。

1.7 qRT-PCR法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平

使用TRIzol試劑提取各組子宮組織中總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測ER、PR、PRLR mRNA表達水平，內參基因為GAPDH。反應程序：95℃預變性10分鐘；95℃變性10秒，55℃退火35秒，72℃延伸1分鐘，循環40次；72℃延伸10分鐘。ER上游引物：5′-CCACCAACCAGTGCACCATT-3′，下游引物：5′-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTTC-3′；PR上游引物：5′-TCGTACAAGCATGTCAGTGGACAC-3′，下游引物：5′-CATGGTAAGGCACAGCGAGTACAA-3′；PRLR上游引物：5′-CCAGATGGAAGTGTACTGCTTGGTA-3′，下游引物：5′-GGTGGAATCCTGGGACAGATC-3′；內參GAPDH上游引物：5′-CCACTTGAAGGGTGGAGC-3′，下游引物：5′-TGAAGTCGCAGGAGACAA-3′。Ct值為擴增產物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環數，相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.8 蛋白印跡(western blot，WB)法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平

使用蛋白提取試劑盒提取各組子宮組織中總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質并轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1小時，分別加入ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1小時，免疫反應化學發光法顯色，Tanon 600圖像分析系統拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠子宮內膜病理形態的影響

空白對照組子宮內膜結構完整，上皮細胞排列緊密，血管和腺體清晰可見。模型組子宮內膜嚴重受損，腺體和血管稀少，子宮內膜變薄明顯。與模型組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組子宮內膜的厚度及子宮內膜腺體、血管數量明顯增加，大鼠子宮組織病理學評分顯著升高(P<0.05)；與舒爾經膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊高劑量組，大鼠子宮組織病理學評分顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學評分差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注： A：空白對照組；B：模型組；C:陽性對照組；D:舒爾經膠囊低劑量組；E:舒爾經膠囊高劑量組。

表1 各組大鼠子宮組織病理學評分比較

2.2 舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 舒爾經膠囊對藥物流產后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

表2 各組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平比較

表3 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平比較

表4 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平比較

圖2 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達情況

3 討論

數據顯示，中國每年人工流產約有1300萬人次，藥物流產約有1000萬人次，位居世界第一，盡管各種避孕方法正在不斷推廣，但人工流產的發生率仍在不斷增加[9]。手術流產為機械性操作，對機體損傷大，易導致盆腔炎、月經紊亂等并發癥，恢復時間長，大多數女性難以完全接受，而藥物流產通常具有安全、有效、簡便等特點，更易被人接受[10]。然而，藥物流產后流產不全、絨毛蛻膜殘留、子宮收縮乏力及繼發宮內感染會導致月經紊亂、貧血、異常子宮出血、盆腔炎、不孕等危害，是藥物流產亟需進一步解決的問題[11]。

舒爾經膠囊成分為當歸、牡丹皮、赤芍、柴胡、桃仁、陳皮、香附、牛膝、益母草、延胡索、白芍，主要用來治療痛經及月經量少等癥狀[12]。近年來發現，舒爾經膠囊在治療人工流產并發癥上具有較好的療效。杜就舊等[13]研究表明，舒爾經顆粒聯合戊酸雌二醇預防人工流產術后宮腔粘連的療效優于單用戊酸雌二醇。孫川等[8]研究表明，人流術后采用舒爾經顆粒聯合補佳樂進行治療，可以縮短流產后出血時間及轉經時間，改善臨床癥狀及體內性激素水平，增加子宮內膜厚度。本研究結果顯示，與模型組相比，舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學評分顯著升高，子宮內膜厚度及子宮內膜腺體、血管數量顯著增加，其中膠囊高劑量組大鼠相應指標與陽性對照組差異無統計學意義，說明舒爾經膠囊可促進胚囊排出，減少絨毛、蛻膜殘留，增加子宮內膜厚度及子宮內膜腺體，促進血管生成，使子宮內膜得到較好地修復，效果與傳統藥物宮血寧相差不大。

雌激素、孕激素、催乳素是維持女性正常內分泌、反映婦科內分泌功能的重要激素，在妊娠過程中，正常的雌激素、孕激素、催乳素等激素水平與子宮內膜中激素受體結合，在子宮內膜變化中起重要作用[14-16]。Chlebowski等[17]研究表明，孕激素可減輕子宮內膜癌風險，在絕經后婦女中，孕激素聯合雌激素連續使用可降低子宮內膜癌的發病率。Mei等[18]研究表明，雌激素可以通過CXCL12/CXCR4生物軸上調介導的自噬抑制促進人分泌期子宮內膜基質細胞的存活。宋秀云等[19]研究表明，對于臨床上選擇藥物流產的患者，為了減輕流產后陰道出血量，可在治療中加用雌激素、孕激素，不僅能提高止血效果，還可減少并發癥。李福明等[20]研究表明，扶正消癌方聯合他莫昔芬調節血清催乳素、孕酮、雌二醇等性激素水平，可緩解他莫昔芬所致子宮內膜增厚。本研究結果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，提示大鼠藥物流產后子宮內膜嚴重受損，體內性激素及相應受體表達均受到影響。進一步研究發現，與模型組相比，陽性對照組、舒爾經膠囊低劑量組、舒爾經膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，提示舒爾經膠囊可提高藥物流產大鼠血清中性激素及子宮內膜中相應受體水平，進而使嚴重受損的子宮內膜得到修復。

綜上所述，舒爾經膠囊可以提高藥物流產后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR表達水平，促進子宮內膜修復，改善子宮內膜形態，值得進一步進行臨床研究。