貝參茱萸方抑制H22肝癌模型小鼠腫瘤生長的作用及其分子機制

陳燕妮 王蘭蘭 查青 史海龍 馮雪松 晁旭

中醫(yī)藥在治療腫瘤方面有著上千年的經(jīng)驗積累，中醫(yī)學者在腫瘤免疫和重塑腫瘤微環(huán)境以及誘導細胞凋亡和自噬[1]等多個方面研究中藥單味藥、復方藥對腫瘤的治療作用。實驗組前期研究表明，貝參茱萸方含藥血清對HepG2細胞的生長具有抑制作用，其抑制作用與含藥血清的濃度具有相關性，貝參茱萸方含藥血清能夠誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，將細胞周期阻滯于G1期[2]。本實驗通過貝參茱萸方對H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用和機制進行研究，進一步評價中醫(yī)藥治療腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級40只雄性昆明小鼠，周齡為6～8周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物編號：SCXK(京)2016-001。

1.2 藥物與試劑

貝參茱萸方處方：土貝母20 g、西洋參15 g、絞股藍10 g、山茱萸10 g、生甘草5 g。購自陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院。將60 g中藥材先加1000 mL的超純水浸泡2小時，然后加熱煎煮1小時倒出藥液，再次加入1000 mL的超純水煎煮1小時，分離藥渣，保留所煎出的藥液。將第1次和第2次藥液混勻，繼續(xù)熬制藥物將藥物調(diào)制為1 g·mL-1、0.5 g·mL-1、0.25 g·mL-1三個不同濃度于-4℃冰箱儲存；H22細胞(編號：ZQ0109)購自上海茂科生物科技有限公司。

1.3 瘤細胞懸液的制備

將凍存H22細胞復蘇，傳代2次后，用PBS溶液將細胞調(diào)制成1×107個/mL的細胞混懸液。然后將0.1 mL瘤細胞混懸液接種在2只昆明小鼠的腹腔內(nèi)，7天后，小鼠腹腔內(nèi)長滿瘤性腹水。用1 mL無菌針管抽取小鼠的腹水，1000 rpm 離心5分鐘，然后用生理鹽水調(diào)制成1×107個/mL瘤細胞混懸液，備用。

1.4 實驗動物分組及給藥

40只昆明小鼠適應性飼養(yǎng)一周，于造模前12小時禁食不禁水，造模當天用隨機分組法將40只小鼠分為5組，分別為空白組、模型組、貝參茱萸方高濃度組、貝參茱萸方中濃度組、貝參茱萸方低濃度組，每組8只，分組完成后給除空白組外的所有小鼠的右前肢皮下接種制備好的細胞混懸液0.1 mL，接種好后每組小鼠尾巴用記號筆標號，在空白組小鼠右前肢皮下注射0.1 mL生理鹽水，用記號筆尾巴標號。造模后第二天用不同濃度藥物進行小鼠灌胃，貝參茱萸方高濃度組灌胃藥液濃度為1 g·mL-1、貝參茱萸方中濃度組藥液灌胃濃度為0.5 g·mL-1、貝參茱萸方低濃度組藥液灌胃濃度為0.25 g·mL-1，灌胃周期為30天。空白組與模型組用生理鹽水灌胃治療，所有小鼠的灌胃劑量為0.4 mL/只，每日一次。

1.5 動物一般情況觀察

觀察小鼠的飲食、睡眠、活動、皮毛顏色等，測量小鼠的體重、飲食、腫瘤大小變化，觀察小鼠的死亡只數(shù)并記錄死亡時間。待小鼠成瘤后每隔3日對小鼠體重、飲食量進行測量并用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短直徑分別記為a、b，用以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=a×b2/2；

1.6 標本采集

末次灌胃2小時后用頸椎脫臼法快速處死各組小鼠，用玻璃分針小心剝離小鼠瘤組織，將每只小鼠的瘤組織用生理鹽水沖洗兩遍，1/2瘤裝入凍存管放-80℃冰箱儲存，其余1/2瘤組織用4%的多聚甲醛固定。

1.7 檢測指標

HE染色法分析腫瘤組織病理情況；免疫組化法分析Ki67在各組H22肝癌荷瘤小鼠內(nèi)的陽性細胞率將包埋切片的片子按照二步法免疫組化試劑盒(DAKO，K5007)說明進行檢測。每個組至少選取3張不同的片子進行拍照，應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析得出總細胞數(shù)量和陽性細胞數(shù)量得出陽性細胞率(%)=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100)；Western blot法檢測腫瘤組織中caspase-3、caspase-9的蛋白表達情況：液氮研磨肝癌組織，提取蛋白，蛋白定量后上樣轉(zhuǎn)膜，一抗孵育過夜，洗凈一抗(Servicebio，GB11026)，加入二抗(Servicebio，GB23303)，2小時后暗室曝光并掃描膠片分析灰度值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般狀態(tài)

各組小鼠在30天的治療過程中，模型組及貝參茱萸方高濃度組各有1只小鼠在未長出腫瘤前死亡，死亡原因可能為灌胃操作不當。成瘤后小鼠死亡情況：模型組小鼠死亡兩只、貝參茱萸方中濃度組死亡2只、貝參茱萸方低濃度組死亡1只、空白組和貝參茱萸方中濃度組無小鼠死亡。帶瘤小鼠隨瘤體逐漸長大出現(xiàn)了行動受限、后期出現(xiàn)跛行、皮毛顏色暗淡無光澤、脫毛、消瘦、精神狀態(tài)差，腫瘤處出現(xiàn)破潰；用藥組小鼠也出現(xiàn)了行動受限、但精神狀態(tài)比模型組佳，其中貝參茱萸方中濃度組的小鼠行動與精神狀態(tài)最好，皮毛顏色光亮，用藥組小鼠腫瘤均未破潰。

2.2 各組小鼠體重變化

各組小鼠的體重均呈增長趨勢；空白組小鼠的體重變化幅度小，模型組和貝參茱萸方高濃度組的小鼠體重增長幅度最大。結果見圖1。

圖1 貝參茱萸方抑制H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤實驗 各組小鼠平均體重變化圖

2.3 各組小鼠腫瘤體積變化

于造模后第8天開始對腫瘤大小進行測量：(1)空白組小鼠未成瘤，未納入統(tǒng)計；(2)各組腫瘤體積大體呈增長趨勢；(3)在8～20天時，模型組與給藥組腫瘤體積大小區(qū)別不大；(4)第28天 時：貝參茱萸方中濃度(0.5g·ml-1)腫瘤體積最小，模型組腫瘤體積最大；與模型組相比，貝參茱萸高、中濃度組小鼠腫瘤體積在第28天時明顯減小，且結果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見圖2。

2.4 腫瘤組織HE染色結果

(1)空白組小鼠皮下無腫瘤細胞，模型組小鼠腫瘤組織中癌細胞排列緊密，未見細胞的大片壞死區(qū)域和細胞凋亡；(2)與模型組比較，給藥組的腫瘤細胞密度均有減小，且各組細胞形態(tài)有不同程度的壞死和凋亡區(qū)域，其中貝參茱萸方低濃度組的細胞形態(tài)改變最為明顯，貝參茱萸方中濃度組的細胞密度最小。結果見圖3。

注：與模型組相比，aP<0.05。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

2.5 各組腫瘤組織中Ki67免疫組化結果

與空白組比較，模型組小鼠體內(nèi)Ki67的陽性表達明顯(P<0.05)。與模型組相比，貝參茱萸方高濃度組和中濃度組降低(P<0.05)，結果見圖4、表1。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

表1 貝參茱萸方對H22荷瘤小鼠皮下瘤組織中 Ki67表達的陽性率比較

2.6 各組小鼠腫瘤組織中caspase-3和caspase-9的表達

與空白組比，caspase-3、caspase-9在模型組中的表達降低(P<0.05)。與模型組相比，促凋亡因子caspase-3在貝參茱萸方高濃度組、中濃度組的表達升高(P<0.05)，貝參茱萸方高濃度組可以促進促凋亡因子caspase-9蛋白水平的表達(P<0.05)。結果見圖5、表2。

注：A：空白組；B：模型組；C：貝參茱萸方高濃度組；D：貝參茱萸方中濃度組；E：貝參茱萸方低濃度組。

表2 貝參茱萸方對各組小鼠腫瘤組織中 caspase-3和caspase-9的表達比較

3 討論

貝參茱萸方中土貝母為君藥、西洋參和山茱萸為臣藥、絞股藍為佐藥、使藥生甘草，全方具有滋陰補腎和益氣健脾功效，通過疏肝理氣、活血化瘀共湊遏制癌毒的作用[3]。該方中土貝母的皂苷類物質(zhì)是其對抗腫瘤最有效的成份，有研究者[4]用土貝母皂苷作用于轉(zhuǎn)染過綠色熒光蛋白(GFP)基因的人乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7作用24小時后，細胞MDA-MB-231和MCF-7明顯凋亡，在48小時后MDA-MB-231和MCF-7的IC50為(17.03±3.22)、(27.96±0.34) μg·mL-1；土貝母皂苷Ⅰ、Ⅲ能夠抑制腫瘤細胞K562的生長并將細胞周期阻滯的S期以前[5]。土貝母皂苷聯(lián)合化療藥對宮頸癌Hela細胞株誘導24小時后，細胞周期阻滯于G2/M期，土貝母皂苷對細胞Hela的抑制率與藥物濃度和誘導時間呈正相關[6]。西洋參中抗腫瘤的有效成分主要為人參皂苷，西洋參可以抑制腫瘤細胞的生長、對腫瘤細胞具有誘導凋亡、抑制分化等作用[7]。有研究表明山茱萸對肝癌大鼠腫瘤的抑制機制是通過上調(diào)腫瘤組織中B7-H6的表達[8]。山茱萸通過線粒體介導的凋亡通路對由TNF-α和D-氨基半乳糖所致的肝癌細胞具有抑制作用[9]。中藥絞股藍的抗癌機制主要從增強T、B細胞的增殖提高免疫、抑制相關酶的代謝活性以及干擾細胞周期方面起到對抗腫瘤的功效[10]；甘草中的甘草酸和甘草次酸是腫瘤治療中起主要作用的成分[11]，可以在誘導腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮抗腫瘤作用。

Caspase家族是一種直接誘導細胞凋亡解體的蛋白酶系統(tǒng)[12]，內(nèi)源性凋亡途徑主要在由線粒體介導的細胞色素C(Cytochrome C)中，當細胞色素C當被釋放出來后立即與胞質(zhì)中的caspase-9相聯(lián)合，并形成凋亡體，進而啟動caspase-3發(fā)生作用，致使細胞出現(xiàn)凋亡改變[13]。caspase-3、caspase-9的異常表達與胃癌、乳腺導管癌等腫瘤的惡化與轉(zhuǎn)移密切相關[14-15]。近年來很多研究表明caspase-3、caspase-9在促進腫瘤細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用。周進等研究顯示[16]，在誘導腎癌模型小鼠的凋亡過程中，白花蛇舌草能夠明顯促進相關蛋白caspase-3、caspase-9的表達，提高抑瘤率。聶艷萍等[17]在研究吉西他濱誘導HepG2細胞凋亡的機制中發(fā)現(xiàn)，在用吉西他濱作用于HepG2細胞24小時后細胞表面的caspase-3、caspase-9的表達均增強。貝參茱萸方對腫瘤的抑制可能與其增強了腫瘤組織中caspase-3、caspase-9蛋白水平的表達水平相關。

實驗發(fā)現(xiàn)貝參茱萸方可以明顯改善小鼠的狀態(tài)，經(jīng)藥物治療后的小鼠平均每日飲食量比模型組高，皮毛顏色有光澤，脫毛現(xiàn)象少，小鼠活動隨著腫瘤的增大有所受限，但未出現(xiàn)跛行，腫瘤小鼠均出現(xiàn)消瘦，但藥物組小鼠消瘦較模型組不顯，用藥組小鼠未出現(xiàn)腫瘤破潰，小鼠帶瘤生存狀態(tài)較好，其中貝參茱萸方中濃度組對于改善小鼠狀態(tài)以及增加小鼠飲食量的效果最為顯著。在今后臨床治療肝癌時貝參茱萸方可以配合西醫(yī)放化療增強治療功效，改善患者帶瘤生存質(zhì)量。