針刺帶脈穴對腹型肥胖小鼠白色脂肪棕色化影響的研究

于夢蕓 王海英 梁翠梅 胡慧

腹型肥胖(abdominal obesity)是指脂肪在腹部或腹腔內臟部積聚過多，故又稱中心性肥胖。隨著世界腹型肥胖的發生率的增加，許多人生活在代謝綜合征的高風險中，而代謝綜合征會促進動脈粥樣硬化性血管疾病和2型糖尿病等并發癥的發展[1]。

哺乳動物體內的脂肪組織分為白色脂肪組織(white adipose tissue， WAT)和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)，兩種脂肪組織通過WAT存儲能量、BAT消耗能量的方式共同調節體內能量代謝[2]。研究表明，在冷刺激或β腎上腺素能受體激動劑的作用下，小鼠WAT中會出現散在的棕色樣脂肪細胞，且細胞內線粒體數量增加，氧化磷酸化加快，這種分化過程稱為白色脂肪棕色化，多種轉錄因子與信號通路參與其中[3]。UCP1是BAT的特異性表達基因，參與產熱調節，是白色脂肪棕色化的主要體現[4]，PGC-1α在調動UCP1活性過程中起重要作用[5]，PRDM16是促進棕色脂肪分化的關鍵因子[6]。臨床療效已證明針刺具有改善患者的腹型肥胖的作用[7-8]，針灸可通過調節下丘腦中樞神經抑制食欲[9]，調節過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)促進脂肪分化[10]等多種途徑改善肥胖。因此本研究通過高脂飲食建立腹型肥胖小鼠，以WAT中的PGC-1α、UCP1、PRDM16基因和蛋白表達變化為切入點，從白色脂肪棕色化的角度探討針灸治療腹型肥胖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級4周齡雄性C57BL/6J小鼠35只，體質量(14±1)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(京)2012-0036， 飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心。飼養條件：溫度為(22±2)℃，濕度為50%～60%左右。人工控制室內照明，保持12小時晝夜交替循環。所有小鼠均可自由進食飲水，適應環境1周。

1.2 試劑及儀器

一次性無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，北京中研太和醫療器械有限公司)；PGC-1α、UCP1和PRDM16抗體(貨號：ab54481、ab10983、ab106410，美國Abcam)；β-Actin(貨號：AC001-M,美國Santa Cruz)；山羊抗兔igG、山羊抗鼠igG(貨號：SH-0031、SH-0011,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；igG TRIzol?Reagent、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(貨號：15596-018、AM2044、4385614，美國Invitrogen)；PVDF轉印膜(貨號：XLL092-2，美國Thermo Fisher)；AL204電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)； 石蠟切片機(德國LEICA)；NIKON Eclipse ci顯微鏡、NIKON digital sight DS-FI2成像系統(日本NIKON公司)。CMNS6-1型脈沖針灸治療儀(無錫佳健醫療器械有限公司)；小鼠固定器(150 mm×65 mm×50 mm，上海華巖儀器設備有限公司)。

1.3 造模與分組

隨機抽取6只小鼠為空白對照組，采用一般飼料喂養，其余29只造模小鼠采用高脂純合飼料(購自Research DIETS公司，含20%蛋白、45%脂肪、35%碳水化合物，能量密度4.7 kcal/g)喂養，喂養12周后，稱量體重、腹圍。造模組體重、腹圍大于空白組平均值20%的小鼠被認定為腹型肥胖[11-12]。將造模成功的12只小鼠隨機分為模型組6只和針刺組6只，繼續以高脂飼料喂養。

1.4 干預方法

針刺組：按照《實驗針灸學》中常用實驗動物針灸穴位附圖中的取穴方法取雙側“帶脈”穴。將小鼠置于定制的小鼠固定器內固定，充分暴露針刺部位，用0.30 mm×25 mm一次性無菌針灸針，直刺雙側“帶脈”穴，深度3～4 mm，連接電針儀的正負極，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，電流強度1.5 mA，隔日1次，15分鐘/次。模型組和空白組同步固定，不做任何其他處理。共干預8周。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 體質量和腹圍的測定 干預前后測量體質量、腹圍。在天平上放置一個小盆，計數調“0”，稱取小鼠體重；1人將小鼠抓起固定，使其仰臥位，另1人用卷尺測量小鼠腹部劍突與后肢間垂直距離中點的周徑。

1.5.2 脂肪組織HE 染色 將WAT、BAT經4%多聚甲醛溶液固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，制片(4 μm厚)，HE染色，在光學顯微鏡下觀察并描述，對應主要描述部位進行拍照。

1.5.3 Western Blot法檢測WAT中PGC-1α、UCP1、PRDM16蛋白的表達水平 取100 mg的WAT，加入1 mL RIPA裂解液，勻漿充分至無塊狀；冰浴中超聲粉碎組織，4℃ 12000 rpm離心10 分鐘；輕取上清液進行BCA法蛋白定量，制備樣品；制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉膜，室溫下封閉30 分鐘。UCP1和PGC-1α一抗以1∶1000稀釋，β-Actin一抗以1∶5000稀釋，4℃過夜孵育。次日用洗膜后二抗，室溫孵育2小時，再次洗膜。將混勻后的ECL發光液加于PVDF膜，在成像系統中成像，imageJ軟件進行灰度值處理分析，以β-Actin為內參，分別以UCP1、PGC-1α、PRDM16與內參比值為相對表達量。

1.5.4 熒光定量PCR法檢測WAT中PGC-1α、UCP1、PRDM16的mRNA的表達 將50 mg的WAT充分研磨后加入1 mL Trizol震蕩混勻裂解，離心，取上清加入200 μL氯仿，漩渦震蕩混勻，再離心取上清液加入等體積的異丙醇，離心，加入1 mL75%乙醇后離心，棄上清，將沉淀真空干燥10分鐘加入30 μL DEPC水中。進行RNA鑒定及反轉錄，合成cDNA。擴增按照以下條件反應：95℃預變性2分鐘，95℃變性15秒，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環。反應結束以后，PCR儀給出各個反應孔的Ct值，以GAPDH基因為內參對照，根據公式2計算各個樣本的相對表達量。引物序列見表1。

表1 實驗中的引物信息

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠體重、腹圍的變化

針刺治療前，與空白組相比，模型組的體重和腹圍明顯增加(P<0.05，P<0.05)，說明造模成功。針刺治療后，與空白組比較，模型組體重和腹圍顯著增加(P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組的體重和腹圍明顯下降(P<0.05，P<0.05)。見表2。

2.2 各組小鼠雙側腎周白色脂肪及肩胛間棕色脂肪病理形態變化

在白色脂肪中，空白組脂肪細胞形態結構正常，排列緊密，呈蜂窩狀；模型組與空白組相比細胞體積明顯增大，呈現出大空泡的脂肪室，且形狀不規則，白色脂肪特征明顯；針刺組白色脂肪細胞出現多室，細胞變小、變圓，組織更加致密；在棕色脂肪中，空白組小鼠呈現近圓形的小的脂肪室，脂肪細胞旁邊具有豐富的毛細血管；模型組小鼠呈現出較大的、單個空泡脂肪室；與模型組相比，針刺組細胞較小，細胞數目增多呈片狀，細胞間的毛細血管更加豐富，表明針刺后小鼠肩胛間的棕色脂肪細胞出現了增殖與分化。見圖1。

注：A:空白組白色脂肪；B:模型組白色脂肪；C:針刺組白色脂肪；D:空白組棕色脂肪；E:模型組棕色脂肪；F：針刺組棕色脂肪。

表2 各組小鼠體重、腹圍治療前后的比較

2.3 針刺對WAT中UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白水平的影響

與空白組相比，模型組的WAT中的UCP1、PGC-1α和PRDM16蛋白水平明顯下降(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組的UCP1和PRDM16蛋白水平明顯升高(P<0.05，P<0.05), PGC-1α呈上升趨勢但無統計學差異。見表3、圖2。

表3 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16蛋白表達的比較

圖2 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16蛋白表達的比較

2.4 針刺對WAT中UCP1、PGC-1α和PRDM16 mRNA表達的影響

與空白組相比，模型組WAT中UCP1、PGC-1α和PRDM16 mRNA表達顯著下降(P<0.05，P<0.05，P<0.05)；與模型組相比，針刺組WAT中UCP1和PRDM16 mRNA表達明顯上升(P<0.05，P<0.05)，PGC-1αmRNA表達呈上升趨勢，但無明顯統計學差異。見表4。

表4 各組小鼠WAT中UCP1、PGC-1α、 PRDM16 mRNA表達的比較

3 討論

脂肪組織是機體主要的代謝器官，在能量穩態中具有關鍵作用[13]。UCP1的過度表達是白色脂肪棕色化的一個重要標志，在BAT中尤為明顯。與其他細胞相比，棕色脂肪細胞主要通過UCP1以熱能(非戰栗性產熱)的形式，將線粒體膜間質子滲透內膜至線粒體基質中，從而更大程度地解偶聯三磷酸腺苷合成過程中線粒體的電子傳遞。PGC-1α是脂肪棕色化過程中一個重要的轉錄因子，是線粒體產熱和氧化磷酸化的主要調節基因，它能夠結合UCP1的啟動子區，高表達的PGC-1α可上調UCP1的表達水平，加速機體產熱[14]。PRDM16既可促進棕色脂肪的產生，也能抑制白色脂肪的分化。WAT中PRDM16的表達代表白色脂肪棕色化的程度[15]，同時PRDM16過度表達可以誘導UCP1和PGC-1α的高表達[16]。本研究針刺干預后腹型肥胖小鼠的體重和腹圍均明顯下降；其病理圖片WAT和BAT細胞變小，更致密，表明針刺可以促進棕色樣脂肪和BAT的增殖和分化。同時針刺組的WAT中棕色脂肪的標志物的UCP1、PGC-1α和PRDM16的mRNA表達和蛋白水平均上調，更是驗證針刺可能通過調節脂肪棕色化，增加機體能量消耗，減少脂肪累積，進一步改善肥胖。

腹型肥胖的起因多與帶脈約束功能失調有關，帶脈“起于季肋，環身一周”，經帶脈、五樞、維道三穴與足少陽膽經交會。以橫行腹部為特點，起到約束縱行上下的諸條足經和奇經的作用。帶脈失約，則脾不升清、胃不降濁如“腹滿腰溶溶若坐水中”，腹部脂肪堆積則“縱腹垂腴”，腹型肥胖的病變部位正處于帶脈循行的范圍內。因此，本研究以通調帶脈為治則，選用帶脈與足少陽膽經的交會穴帶脈穴，《針灸大成》記載，帶脈穴可主治“腰腹縱，溶溶如囊水之狀”，因此針刺帶脈穴可以激發帶脈經氣，提高約束能力，改善腹型肥胖。李敏等[17]以帶脈穴位埋線法治療腹型肥胖中風患者療效顯著，優于二甲雙胍組和空白對照組。沈凌宇等[18]選用帶脈、天樞、大橫等穴位對腹型肥胖多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者針刺治療12周后發現，通調帶脈針刺法可顯著降低腹型肥胖PCOS患者的腰圍、血清空腹胰島素和胰島素抵抗指數。李媛媛等[19]針刺治療代謝綜合征大鼠帶脈穴4周后，針刺組大鼠體重、空腹血糖值、胰島素抵抗值(HOMA insulin-resistance，HOMA-IR)以及血脂三項包括甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)較模型組明顯下降(P<0.05)，表明針刺帶脈穴可以改善代謝綜合征大鼠胰島素抵抗，具有減重調脂降血糖的作用。王海英等[12]以電針腹型肥胖大鼠雙側“帶脈穴”干預8周后，可有效減少腹型肥胖大鼠體重和腹圍，降低血清中TC、TG、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平，改善腹型肥胖大鼠肝臟脂質代謝。本研究在中醫整體觀和經絡辨證的基礎上，擬通調帶脈法治療腹型肥胖取得良好的效果，與上述結論相符合。

綜上所述，針刺帶脈穴可明顯抑制高脂飲食誘導的腹型肥胖小鼠體重和腹圍的增長，改善WAT和BAT細胞形態，增加WAT中棕色脂肪的標記物UCP1、PGC-1α和PRDM16基因和蛋白的表達，激活棕色脂肪組織活性的同時誘導白色脂肪棕色化，增加產能，減少白色脂肪在腹部的堆積，在研究肥胖等相關代謝性疾病中具有重要意義。