肝細胞生長因子激酶抑制劑在乳腺癌上皮-間充質轉化及細胞增殖侵襲中的作用△

劉海旺，張宏旭，劉燃，郝美玲，李春輝#

承德醫學院附屬醫院1病理科，2乳腺科，3麻醉科，河北 承德 067000

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，按性別估算的10種主要腫瘤類型中，乳腺癌在女性中發病率居第一位，病死率居第二位[1]。已知肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）及其受體c-MET的信號轉導與胚胎發育、組織細胞修復密切相關，而HGF/c-MET信號轉導的異常調節與腫瘤的發生、發展及惡性生物學行為密切相關，包括腫瘤細胞的侵襲、轉移、上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及血管生成等[2]。HGF是c-MET的配體，c-MET可以通過自身突變、過表達等途徑激活其配體HGF的作用，促使相應的信號轉導級聯反應，進而對人體生物學和生化功能產生影響[3]。EMT促進腫瘤細胞的侵襲、遷移和抑制凋亡，在腫瘤侵襲轉移中起著重要作用。多個因子如蝸牛家族轉錄抑制因子1（Snail family transcriptional repressor 1，Snail1）、蝸牛家族轉錄抑制因子2（Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和波形蛋白（Vimentin），它們在轉錄和翻譯等水平誘導EMT[4]。本研究旨在研究HGF/c-MET激酶抑制劑在乳腺癌EMT及細胞侵襲中的潛在機制，進而了解激酶抑制劑在體內外的作用機制，從而為乳腺癌患者的治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MCF-7細胞購自中國醫學科學院基礎醫學細胞中心。c-MET和E-cad引物均由上海生工公司設計。E-cad、Snail、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）單克隆抗體均購自Santa Cruz公司，β-actin鼠單克隆抗體和辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的兔抗鼠二抗均購自北京中杉金橋生物技術公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RPMI-1640培養基均購自Hy-Clone公司，Transwell小室購自美國康寧公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑均購自TaKaRa試劑公司，CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物公司，PHA-665752小分子抑制劑購自selleck公司，TBST、RIPA裂解液和電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 在37℃、5%CO2條件下培養乳腺癌MCF-7細胞，加入適量含10%FBS的RPMI-1640培養基，細胞每2天換液一次，然后按1∶3比例傳代。培養至對數生長期，用0.25%胰蛋白酶消化處理并制備成單細胞懸液，用于后續實驗。實驗分組包括：空白組（單獨培養基）、對照組（培養基+DMSO）、研究組（培養基+0.1 μmol/L PHA-665752組，培養基+0.5 μmol/L PHA-665752組，培養基+1.0 μmol/L PHA-665752組）。

1.2.2 CCK- 8法檢測細胞增殖能力 將乳腺癌MCF-7細胞制備成單細胞懸液分別接種于96孔板，每孔100 μl，培養12 h后分為研究組和對照組，繼續孵育24 h后，在上述培養基孔中加入終濃度為10%的CCK-8試劑，在37℃培養箱中繼續孵育2 h。酶聯免疫檢測儀于450 nm波長下檢測各孔吸光度（A）值，并繪制腫瘤細胞生長曲線。細胞活力（%）=（研究組A值-空白組A值）（/對照組A值-空白組A值）×100%。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將基膜基質原液和預冷的無血清RPMI-1640培養液按1∶3比例配置上室凝膠液，取50 μl凝膠液均勻覆蓋于Transwell小室底部。取處于對數生長期的MCF-7細胞，調整細胞密度為3×105/ml，吸取100 μl細胞懸液置于上室孵育24 h，再取出Transwell小室，按照說明書進行固定、染色，膜的下室表面細胞即為侵襲細胞，顯微鏡觀察染色細胞，每張片子選取5個視野，統計細胞數目算出平均值，每組設置3個平行小室，重復3次，以穿膜細胞數評價其侵襲能力。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction， qRT-PCR）檢測mRNA相對表達量 收集培養皿中的細胞，用Trizol試劑提取乳腺癌MCF-7細胞總RNA。逆轉錄生成cDNA，用于后續PCR擴增，以β-actin作為內參基因，PCR參數設置：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃ 10 s，40個循環，結果以熒光閾值循環數（Ct）值輸出，依據 2-△△Ct公式[5]，計算目的基因相對于內參基因的相對表達量，再進行數據統計分析，每組進行3次實驗，取均值。所有上述步驟嚴格按照說明書操作，引物序列詳見表1。

表1 c-MET、E-cad、 β-actin基因的引物序列

1.2.5 蛋白質印跡法（Westernblot）檢測蛋白相對表達量 采用蛋白提取試劑盒提取研究組和對照組乳腺癌MCF-7細胞的總蛋白，采用紫外分光光度計測定提取的蛋白質濃度，再經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉膜至甲醇預處理過的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），再用脫脂牛奶封閉，滴加兔抗人E-cad、N-cad和Snail一抗（1∶500），4℃孵育過夜，加入TBST洗膜，加入HRP標記的二抗（1∶1000）孵育1 h，ECL顯示，收集影像，采用凝膠圖像處理系統軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 c-MET抑制劑PHA-665752對乳腺癌MCF- 7細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示，分別用0.1、0.5、1.0 μmol/L PHA-665752劑量處理 12、24、48 h后，c-MET激酶抑制劑劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖能力（F=53.367、116.219、44.758，P＜0.05）。與對照組比較，0.1 μmol/L PHA-665752處理48 h后細胞活力降低（P＜0.05）；與0.1 μmol/L PHA-665752組比較，0.5 μmol/L PHA-665752處理24、48 h后細胞活力均降低（P＜0.05）；與0.5 μmol/L PHA-665752組比較，1.0 μmol/L PHA-665752處理12、24、48 h后細胞活力均降低（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時間點各組乳腺癌MCF- 7細胞活力的比較（%）

2.2 乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的比較

Transwell檢測結果顯示，0.5 μmol/L PHA-665752研究組MCF-7細胞處理24 h后侵襲細胞數為（24.33±1.53），少于對照組的（93.00±5.57），差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖1）

圖1 Transwell法檢測 0.5μmol/LPHA-665752研究組與對照組乳腺癌MCF- 7細胞的侵襲能力（結晶紫染色，×100）

2.3 c-MET、E-cad mRNA相對表達量的比較

處理12 h時，對照組與0.5 μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF-7細胞c-MET、E-cadmRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。處理24 h時，0.5 μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF-7細胞c-METmRNA相對表達量低于對照組，E-cadmRNA相對表達量高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同時間點兩組細胞c-MET、E-cad mRNA相對表達量的比較（± s）

表3 不同時間點兩組細胞c-MET、E-cad mRNA相對表達量的比較（± s）

注：*與同時間對照組比較，P＜0.05

指標c-MET mRNA E-cad mRNA 12 h 24 h 12 h 24 h 0.73±0.02 0.51±0.02 0.40±0.03 0.43±0.03 0.66±0.07 0.24±0.05*0.44±0.02 0.66±0.05*時間 對照組0.5 μmol/L PHA-665752 組

2.4 EMT相關蛋白表達情況的比較

通過形態學觀察，與對照組相比，0.5 μmol/L PHA-665752組MCF-7細胞處理24 h后較密集、細胞未拉長，未出現EMT形態特點。Western blot結果顯示，0.5 μmol/L PHA-665752組 MCF-7細胞E-cad蛋白表達水平高于對照組，N-cad、Snail蛋白表達水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2、表4）

圖2 Western blot法檢測對照組與0.5μmol/L PHA-665752組乳腺癌MCF- 7細胞中E-cad、N-cad、Snail蛋白表達情況

表4 0.5 μmol/L PHA-665752組與對照組乳腺癌MCF-7細胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表達水平的比較（±s）

表4 0.5 μmol/L PHA-665752組與對照組乳腺癌MCF-7細胞中Snail 、N-cad 、E-cad 蛋白表達水平的比較（±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組0.5 μmol/L PHA-665752組E-cad 0.42±0.02 0.62±0.04*N-cad 0.62±0.03 0.41±0.04*Snail 0.71±0.02 0.34±0.05*

3 討論

乳腺癌是全世界發病率位居前列的腫瘤，也是女性中最常見的惡性腫瘤，每年新增病例209萬例（占女性癌癥總數的24.2%），每年因腫瘤導致60萬患者死亡[6]。乳腺觸診結合高頻超聲篩查乳腺癌并進行跟蹤隨訪發現，城鎮婦女乳腺癌發病率明顯高于農村婦女[7]。c-MET基因位于7號染色體上，由50 kD的胞外α鏈和140 kD的一個跨膜β鏈通過二硫鍵相連形成異二聚體，受體具有自身磷酸化活性特點[8]。c-MET是HGF的細胞表面受體，其蛋白表達與乳腺癌組織學分級和淋巴結轉移有關，c-MET在乳腺癌中過表達可能參與乳腺癌的進展[9]。Motomura等[10]研究提示c-MET和PKCλ共同參與了乳腺癌的進展，并導致乳腺癌預后不良。研究證實，結腸癌轉移相關基因（metastasis-associated in colon cancer protein 1，MACC-1）與 c-MET共同參與乳腺癌細胞增殖、浸潤及血管生成，與組織分化程度、浸潤程度、淋巴結轉移及臨床分期顯著相關[11]。本研究中，與對照組比較，使用c-MET激酶抑制劑后c-METmRNA表達受到抑制，E-cadmRNA表達升高，說明c-MET激酶抑制劑PHA-665752可以有效抑制HGF/c-MET信號通路。

當腫瘤發展到一定階段，細胞侵襲和浸潤能力會隨著腫瘤的惡性轉化而增強。EMT在腫瘤細胞浸潤過程中起重要的作用。Tavakolian等[12]研究表明乳腺癌細胞侵襲轉移相關的特征與EMT有緊密聯系，E-cad的表達下調也能顯著增強乳腺癌侵襲轉移能力，而給予外源性E-cad則能夠抑制乳腺癌的轉移；Vimentin表達的增加與腫瘤的侵襲轉移呈正相關。周玨等[13]表明E-cad的表達缺失或下調使細胞間的黏附力下降，促使連環蛋白發生易位，從而激活相關的下游信號分子誘導N-cad等的產生，E-cad下調及N-cad的高表達與腫瘤分化差、高侵襲性密切相關。本研究Western blot結果顯示，與對照組相比，使用c-MET激酶抑制劑后E-cad蛋白表達水平升高，N-cad和Snail蛋白表達水平下降，說明當上皮細胞間黏附能力得到了一定程度的恢復，上皮細胞的侵襲性和遷移能力顯著下降。同時也證明了抑制HGF/c-MET信號通路后乳腺癌EMT及細胞侵襲轉移受到顯著抑制，且隨著抑制劑濃度的增加，EMT及細胞侵襲轉移的抑制程度顯著增加，表明在一定程度內細胞的EMT及細胞侵襲轉移能力與HGF/c-MET信號通路有關。

綜上所述，利用c-MET激酶抑制劑影響HGF/c-MET信號通路可以有效抑制乳腺癌EMT及細胞的侵襲和轉移，其作用機制可能與降低c-MET、N-cad和Snail蛋白表達，升高E-cad蛋白表達有關。但調控HGF/c-MET信號通路的相關小分子抑制劑較多，在后續的實驗中希望可以深入研究c-MET抑制劑對其他信號通路及與HGF/c-MET之間交互機制的作用。