農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

李靜　張換樣　朱永紅　吳慎杰　焦改麗

摘? ?要? ?分析了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素：棉花基因型是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素;培養(yǎng)1周且分化不成熟的棉花下胚軸是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的首選外植體;高比值的KT/2，4-D可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的產(chǎn)生，低比值則可以促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生;葡萄糖比麥芽糖更適合誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，胚性愈傷是農(nóng)桿菌侵染較合適的原始轉(zhuǎn)化材料;菌液的培養(yǎng)溫度、濃度、侵染時(shí)間及乙酰丁香酮（AS）濃度都會(huì)影響組織的轉(zhuǎn)化效率;合適的抗生素濃度也是抗性愈傷篩選的必要保證。

關(guān)鍵詞? ?棉花;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法;遺傳轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)培養(yǎng);影響因素

中圖分類號(hào)：S562? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.22.002

棉花（Gossypium spp）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在全球經(jīng)濟(jì)中扮演重要角色，棉花纖維是紡織業(yè)的重要原料，棉稈和棉籽等都可以用作生物質(zhì)能源原料。棉花屬于錦葵科（Malvaceae）棉花屬（Gossypium），該屬有超過(guò)50個(gè)種，廣泛栽培的有4個(gè)種，其中陸地棉（Gossypium hirsutum L.）的種植面積超過(guò)全球棉花種植面積的90%。雖然傳統(tǒng)育種技術(shù)在提高棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、棉籽油品質(zhì)和高溫耐受能力等方面取得了較大的成功，但常規(guī)育種方法得到的棉花品種不同程度地存在種子活力低、易受蟲害草害影響、生長(zhǎng)發(fā)育偏慢、易發(fā)生莖枯病等問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因方法可以通過(guò)直接或間接轉(zhuǎn)化手段，有目的地向棉花體內(nèi)引入控制性狀遺傳的優(yōu)良基因，實(shí)現(xiàn)生物性狀的定向改變，從而提高棉花產(chǎn)量，改良纖維品質(zhì)，增強(qiáng)植株抗蟲、抗除草劑、抗病能力和抗逆性。

1987年，Umbeck、Firoozabady等先后報(bào)道了通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTII）作為選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入珂字棉312和珂字棉210[1-2]。隨后農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體細(xì)胞胚發(fā)生轉(zhuǎn)化法成為國(guó)際上普遍使用的棉花轉(zhuǎn)化手段。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法常用下胚軸或子葉作為受體，從共培養(yǎng)開始，在選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生數(shù)百個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過(guò)胚胎誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚向正常植株發(fā)育和萌發(fā)，最終長(zhǎng)成再生植株，這種多步驟的轉(zhuǎn)化周期較長(zhǎng)（一般為10～12個(gè)月），轉(zhuǎn)化效率較低。

近年來(lái)，不少研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織作為受體感染農(nóng)桿菌時(shí)，恢復(fù)自身正常生長(zhǎng)和存活需要更少的時(shí)間，縮短了整體培育周期，轉(zhuǎn)化效率更高[3-4]。與下胚軸和子葉相比，胚性愈傷組織可能是更好的原始轉(zhuǎn)化材料。這種方法與其他棉花轉(zhuǎn)化方法相比，更加簡(jiǎn)單、可靠和高效，省時(shí)省力。

本文主要從以下兩方面分析通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染獲得再生植株的影響因素：愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響因素;農(nóng)桿菌介導(dǎo)愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素。

1 愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響因素

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是體細(xì)胞被重新編程發(fā)育成類似受精卵形成的胚胎的過(guò)程。體細(xì)胞胚胎發(fā)生有直接發(fā)生、間接發(fā)生兩種形式。在直接發(fā)生方式中，外植體的單個(gè)細(xì)胞直接發(fā)育成胚的類似物;間接發(fā)生方式中，體細(xì)胞胚的形成要經(jīng)過(guò)一個(gè)脫分化過(guò)程形成愈傷組織。1979年，Price和Smith[5]首次報(bào)道了從克勞茨基棉花的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中獲得了體細(xì)胞胚。1983年，Davidonis、Hamilton[6]首次從陸地棉中獲得完整的再生植株。棉花體細(xì)胞胚胎是獲得完整轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵，這個(gè)過(guò)程較為復(fù)雜，受細(xì)胞內(nèi)、外多種因素影響，主要包括內(nèi)在因素（植物基因型、外植體類型等）和外在因素（培養(yǎng)基成分、外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子等）。

1.1 內(nèi)在因素

1.1.1 基因型

基因型是影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的主要因素[7]，影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的其他因素都取決于棉花基因型。眾多研究表明，不同棉種、同一棉種不同品種的胚胎發(fā)生和植株再生能力差異很大，在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚時(shí)所需用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和培養(yǎng)條件等差別也很大[8]。為了研究基因型對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響，Trolinder將38個(gè)栽培種分別用4種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合方式處理，在所有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理中珂字312的胚胎發(fā)生率最高，隨后是珂字304、珂字315和珂字310，其余基因型在所有生長(zhǎng)條件下的胚胎發(fā)生能力較差[9-10]。目前國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室均從珂字棉得到了較多的再生植株，珂字棉已成為棉花組織培養(yǎng)的模式品種，廣泛應(yīng)用于棉花組織培養(yǎng)及其遺傳轉(zhuǎn)化等研究中。也有一些研究發(fā)現(xiàn)非珂字棉品系如岱字棉[11]、中國(guó)培育品種YZ-1[12]的胚胎發(fā)生率也很高。

在四大栽培種中，陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生較易，亞洲棉次之，海島棉和非洲棉較差[13]。棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生是一種受多基因控制的遺傳特性，選育新品種時(shí)可以珂字棉為親本進(jìn)行系統(tǒng)或雜交選育，將這些基因傳遞給育出的新品種，這樣就會(huì)保留住親本中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力和植株再生能力[14]。

1.1.2 外植體

成熟組織（莖、葉、根、葉柄）和非成熟組織（子葉、下胚軸、地上分生組織）都可作為外植體誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎生成[15]。一般而言，內(nèi)源生長(zhǎng)素含量較多的外植體更易生成胚胎[16]，不成熟的外植體可能由于含有較高水平的內(nèi)源生長(zhǎng)素而比成熟組織擁有更強(qiáng)的胚胎發(fā)生能力。Trolinder和Goodin以生長(zhǎng)3 d的珂字棉312為材料，比較了多種外植體胚胎發(fā)生能力，結(jié)果表明下胚軸最易誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，中胚軸和上胚軸次之，種子和子葉較差，葉片和莖段最差。Sakhanokho等研究也發(fā)現(xiàn)下胚軸比子葉更易誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，并首次用下胚軸和子葉培養(yǎng)出海島棉（G.barbadense L.）的再生植株[17]。子葉下胚軸作為外植體要比子葉所需的培養(yǎng)時(shí)間短，并且可阻止無(wú)性系變異的發(fā)生[18]。另外，下胚軸最易誘導(dǎo)出優(yōu)良的愈傷組織[19]。很多研究者都是利用3日齡或6日齡的棉花無(wú)菌苗的下胚軸，切成3～5 mm的小塊進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。建議在棉花組培過(guò)程中最好選用無(wú)菌苗的下胚軸作為外植體。

1.2 外在因素

1.2.1 培養(yǎng)基組成和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

高質(zhì)量愈傷組織的形成是再生出完整棉花植株的關(guān)鍵因素，其中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是最重要的影響因子。高比值的細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的產(chǎn)生。在幾個(gè)棉花品種中，2，4-D和NAA是更加有效的生長(zhǎng)素類似物，雖然二者在誘導(dǎo)胚胎發(fā)生過(guò)程當(dāng)中并無(wú)本質(zhì)區(qū)別，但2，4-D可以更快速地誘導(dǎo)胚胎發(fā)生。2，4-D抑制胚性愈傷組織分化為胚狀體，因此在胚狀體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中一般要去除2，4-D。所有細(xì)胞分裂素中，2iP和 KT在誘導(dǎo)胚胎發(fā)生中效果尤為顯著，2iP、KT分別與2，4-D共同使用時(shí)胚胎發(fā)生率可達(dá)到41.9%、23.5%。2，4-D+KT組合是棉花組織培養(yǎng)中的常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，廣泛用于棉花愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生中[20]。還有其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合也被成功應(yīng)用于不同棉花品種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，其中IBA+KT組合通常用來(lái)繼代培養(yǎng)胚性愈傷組織和促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，近年來(lái)也被成功應(yīng)用于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化調(diào)控[21]。

此外，還有一些其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如IBA和IAA也是愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)常用的生長(zhǎng)素類似物，但之后需用NAA替換才能形成胚胎[22-23]。用子葉下胚軸作外植體可在以毒莠定為生長(zhǎng)素源的培養(yǎng)基上獲得胚性愈傷組織。Benzyl amino purine （BAP）和2，4-D共同作用也可有效誘導(dǎo)胚性愈傷組織的形成[24]。也有報(bào)道稱只有兩種細(xì)胞分裂素而無(wú)生長(zhǎng)素或只有兩種生長(zhǎng)素類似物而無(wú)細(xì)胞分裂素的組合也可以誘導(dǎo)胚胎發(fā)生[25]。在所有方法中，Trolinder等、Firoozabady等采用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合（0.1 mg·L-1 2，4-D+0.1 mg·L-1 KT，5.0 mg·L-1 2iP+0.1 mg·L-1 NAA）對(duì)于多種栽培種均可以獲得疏松的愈傷組織。大多數(shù)研究者在這兩種方法的基礎(chǔ)上依據(jù)培養(yǎng)條件和基因型，調(diào)整生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度來(lái)獲得胚性愈傷組織[26]。

1.2.2 碳源

碳源也是影響棉花愈傷組織誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚形成的一個(gè)重要因素，難再生的棉花品種只能在某一特定的培養(yǎng)基里再生。在愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖中最常用的是MSB培養(yǎng)基，即MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽與B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分相配合的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基的碳源選擇上，棉花愈傷組織誘導(dǎo)宜用葡萄糖作為碳源，而胚性愈傷組織增殖、保存和胚狀體的萌發(fā)過(guò)程宜使用麥芽糖作碳源[27]，也有試驗(yàn)表明4%的葡萄糖是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳選擇。

2 農(nóng)桿菌侵染胚性愈傷組織的影響因素

傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法常用下胚軸或子葉作為受體，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)獲得再生植株。Wu等在培育抗蟲轉(zhuǎn)基因棉時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化愈傷組織比轉(zhuǎn)化其他外植體（下胚軸、子葉）可減少6個(gè)月的時(shí)間。另外，胚性愈傷組織作為外植體時(shí)，Southern雜交分析表明大約有15%的轉(zhuǎn)化效率，平均每個(gè)培養(yǎng)皿能鑒定出8～12個(gè)陽(yáng)性苗。Wu等采用該方法在短時(shí)間內(nèi)每個(gè)愈傷組織獲得30～100個(gè)植株，GUS染色陽(yáng)性率為72.60%[28]。因此，與子葉下胚軸或子葉相比，胚性愈傷組織可能是最好的原始轉(zhuǎn)化材料。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功運(yùn)用主要依賴以下幾個(gè)因素：農(nóng)桿菌將基因轉(zhuǎn)入特定基因組的轉(zhuǎn)化能力;轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生能力。這兩個(gè)因素又依賴于其他幾個(gè)影響因子，如基因型、外植體、農(nóng)桿菌種類、乙酰丁香酮濃度等。

2.1 農(nóng)桿菌菌株

農(nóng)桿菌菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響很大。Sunilkumar和Rathore等用農(nóng)桿菌侵染陸地棉子葉圓盤發(fā)現(xiàn)LBA4404的轉(zhuǎn)化效率明顯高于EHA105[29]。Tohidfar等用LBA4404、EHA101和C58侵染子葉和下胚軸時(shí)，LBA4404的轉(zhuǎn)化效率最高[30]。Leelavathi等、Wu等都利用農(nóng)桿菌LBA4404侵染陸地棉胚性愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因棉。Jin等在轉(zhuǎn)化陸地棉胚性愈傷組織過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)LBA4404的轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)高于C58C3。桿菌菌株如 AGL1、GV3111、GV3101也被用于轉(zhuǎn)基因棉的培養(yǎng)[31]。轉(zhuǎn)化陸地棉時(shí)推薦使用LBA4404菌株，轉(zhuǎn)化效率較高。

2.2 乙酰丁香酮（AS）

AS是受傷的植物組織分泌的酚類化合物，它能夠誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒中一系列Vir基因的表達(dá)[32]，這對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移是必須的。Sunilkumar等首次在棉花轉(zhuǎn)化時(shí)的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)階段和共培養(yǎng)階段添加100 μM的AS，發(fā)現(xiàn)可以顯著提高珂字棉312和其他3個(gè)栽培種（TAM-94L25、TAM-89E51、TAM-94WE37S）的轉(zhuǎn)化效率[33]。Jin等在轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織時(shí)設(shè)置了不同的AS濃度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50 mg·L-1（250 μM）時(shí)可顯著提高轉(zhuǎn)化效率;當(dāng)AS濃度達(dá)到100 mg·L-1（500 μM）時(shí)，轉(zhuǎn)化效率降低[34]。Wu等在轉(zhuǎn)化時(shí)添加0、25、50、75 mg·L-1的AS，發(fā)現(xiàn)AS濃度為50 mg·L-1的轉(zhuǎn)化效率最高[35]。合適的AS濃度可以提高棉花轉(zhuǎn)化效率，但AS濃度高于500 μM時(shí)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。綜上所述，共培養(yǎng)期間添加50 mg·L-1的AS時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。

2.3 農(nóng)桿菌感染濃度、感染時(shí)間

農(nóng)桿菌感染濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。Jin等報(bào)道侵染棉花愈傷組織時(shí)，菌液感染濃度OD600為0.5時(shí)的轉(zhuǎn)化效率比OD600為1.0或1.5時(shí)的轉(zhuǎn)化效率更高。大多數(shù)研究者在侵染愈傷組織時(shí)采用的農(nóng)桿菌感染濃度OD600值為0.3～0.5，Wu采用OD600為0.2～0.3的菌液進(jìn)行侵染。劉傳亮等構(gòu)建棉花規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)在原有轉(zhuǎn)化體系中，選擇的侵染濃度OD600值為0.3～0.7時(shí)，許多切段容易死亡，而適當(dāng)降低菌液感染濃度OD600值至0.1～0.3可提高愈傷組織發(fā)生率，侵染15～20 min為宜。劉衛(wèi)民等試驗(yàn)表明侵染棉花下胚軸所用的農(nóng)桿菌濃度OD600為0.4～05，侵染時(shí)間在10～15 min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，返菌率也很低;而侵染時(shí)間為20～30 min時(shí)，轉(zhuǎn)化率急劇下降，返菌率也顯著升高。綜上所述，農(nóng)桿菌感染濃度OD600值為0.3左右時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。另外，在壓力為186.158 kPa時(shí)，用農(nóng)桿菌菌液真空滲入10 min可以顯著提高轉(zhuǎn)化效率，比常規(guī)轉(zhuǎn)化效率高出一倍多[36]。

2.4 共培養(yǎng)溫度和時(shí)間

Sunilkumar、Rathore和Jin等用可視化蛋白GFP作為標(biāo)記，隨著時(shí)間觀察轉(zhuǎn)基因的定位，該技術(shù)可以幫助優(yōu)化影響轉(zhuǎn)化效率的各種因素，尤其是共培養(yǎng)時(shí)間和溫度。此外，采用可視的篩選標(biāo)記可以在早期輕易找到轉(zhuǎn)基因表達(dá)細(xì)胞系。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染42～45 h后可觀察到GFP的表達(dá)，共培養(yǎng)3 d后GFP穩(wěn)定且大量表達(dá)，4 d時(shí)所有細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到GFP表達(dá)。但外源基因在轉(zhuǎn)基因材料中的瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)是相關(guān)聯(lián)但又不同的，因?yàn)楦咚降乃矔r(shí)表達(dá)并不一定會(huì)導(dǎo)致高水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。多數(shù)棉花轉(zhuǎn)化體系會(huì)采用48 h的共培養(yǎng)時(shí)間。Wu等通過(guò)GUS染色發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)，轉(zhuǎn)化效率并無(wú)差異。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，愈傷組織會(huì)出現(xiàn)褐化和壞死現(xiàn)象，出愈率較低[37-38]。

共培養(yǎng)溫度也是影響轉(zhuǎn)化的重要因素。研究者對(duì)共培養(yǎng)溫度為21 ℃、25 ℃時(shí)，農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)溫度為21 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化效率更高。Wu等在研究農(nóng)桿菌侵染陸地棉愈傷組織時(shí)，設(shè)置了19 ℃、23 ℃、26 ℃等3個(gè)共培養(yǎng)溫度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)溫度在19 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高[32]。

2.5 抗生素

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法中，有兩類常用的抗生素，一類具有篩選作用，如卡那霉素和潮霉素;另外一類用來(lái)殺死農(nóng)桿菌，如氨芐青霉素和頭孢霉素（500 mg·L-1）。在遺傳轉(zhuǎn)化中，很多基因以NPT II（抗卡那霉素）作為選擇標(biāo)記基因，卡那霉素的使用濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)重要因素。有研究表明，將卡那霉素濃度設(shè)為25 mg·L-1，愈傷組織呈淡黃色，生長(zhǎng)迅速，成活率為98%～100%;濃度上升為50 mg·L-1時(shí)，愈傷局部生長(zhǎng)速度變緩，成活率在80%以上;而當(dāng)濃度提升至100～150 mg·L-1時(shí)，愈傷生長(zhǎng)緩慢甚至停滯，成活率也下降至14%～40%。很明顯，高濃度抗生素對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，低濃度抗生素會(huì)導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，再生受到抑制，無(wú)法對(duì)抗性愈傷起到篩選作用。棉花子葉和下胚軸作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生時(shí)，10 mg·L-1或更高濃度的卡那霉素使愈傷組織形成數(shù)量減少;濃度達(dá)到60 mg·L-1時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)、增殖和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過(guò)程完全受到抑制。成熟的體細(xì)胞胚對(duì)卡那霉素不敏感，此階段很難篩選到轉(zhuǎn)化子[39]。

在轉(zhuǎn)基因的愈傷組織誘導(dǎo)和增殖階段，卡那霉素的最佳使用濃度為40～60 mg·L-1;而在篩選轉(zhuǎn)基因的胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚時(shí)，卡那霉素的濃度應(yīng)增加至200 mg·L-1。100 mg·L-1的卡那霉素篩選3次，7～8周，也能獲得很好的篩選效果。

另外，在培養(yǎng)基中原始愈傷組織的大小也會(huì)影響愈傷組織的出愈率，規(guī)格較大的愈傷組織更易存活下來(lái)。及時(shí)傳代培養(yǎng)及培養(yǎng)皿中愈傷組織的數(shù)量也會(huì)影響體細(xì)胞胚胎的發(fā)芽率，這是棉花組培中的一個(gè)重要步驟。因此，研究人員必須注意這些方面以提高整體轉(zhuǎn)化效率。

3 結(jié)語(yǔ)

近些年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的不斷創(chuàng)新和完善，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化得以在全國(guó)范圍內(nèi)推廣開來(lái)，呈規(guī)模化生產(chǎn)。例如，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣研究員主持的“棉花規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系平臺(tái)的建設(shè)及其應(yīng)用”有效組裝多種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化、高效率的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作，年均獲得轉(zhuǎn)基因棉花植株6 000株以上，不僅降低了轉(zhuǎn)基因成本，還拓寬了受體的基因型范圍和外植體范圍。現(xiàn)階段除了棉花下胚軸之外，葉柄、真葉和根等都可以通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株，但有待進(jìn)一步探究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程受眾多內(nèi)在和外在因素的綜合影響的分子機(jī)制，以便將遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用于更多的商用棉花品種，減免雜交回交，縮短育種年限。

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