貓爪草中多酚的單因素提取工藝研究

王 銳，陽 莉，徐本華

(昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000)

貓爪草(Ranunculi Ternati Radix)屬毛茛科(Ranunculaceae)小毛茛(Ranuncuius ternatus Thunb.)的塊根部分，又名三散草、全心草，大量分布在我國河南信陽地區，是國家重點發展的藥材之一。據藥典記載貓爪草性溫，歸肝、肺經，味甘、辛，具有清熱解毒、化痰散結、消腫止咳、截瘧等多方面療效[1,2]。貓爪草中含有黃酮、生物堿、多酚、多糖、皂苷、揮發油及有機酸類等多種生物活性成分[3]。現代藥理及臨床研究表明貓爪草不僅具有抗菌、抗氧化、調節免疫等功效，而且對于淋巴結核、淋巴瘤及多種癌癥有療效[4,5]。目前，貓爪草中有效成分的提取多體現在對貓爪草中黃酮、多糖、皂苷、小毛茛內酯等成分的提取工藝研究，而對貓爪草中多酚類物質的提取工藝研究方面少見報道[6]，本實驗采用乙醇提取法，通過乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，以貓爪草中多酚浸出量為指標，對貓爪草多酚類物質提取工藝進行研究，為其在多酚類物質方面的研究提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7200型紫外可見分光光度計(上海儀天科學儀器有限公司)；HH-S24數顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司)；XFB-200家用粉碎機(吉首巿中湘制藥機械廠)；AF2004精密電子分析天平(上海上平儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

貓爪草購自昆明市中藥店；沒食子酸標準品(上海金穗生物科技有限公司)；福林酚試劑(上海金穗生物科技有限公司)；無水乙醇，碳酸鈉等均為分析純。

2 實驗方法

2.1 原料預處理

將貓爪草洗凈置于電熱恒溫鼓風干燥箱70℃下烘干至恒重，粉碎過100目分樣篩，裝好備用。

2.2 多酚標準曲線的繪制

采用福林酚比色法測定多酚[7]。精密吸取質量濃度196 mg/L沒食子酸標準品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于25 mL比色管中，補充去離子水至5 mL，加入1 mol/L福林酚試劑1.5 mL，搖勻，室溫下放置5 min，然后加入10%碳酸鈉溶液3 mL，加去離子水定容至刻度，搖勻，置于30℃水浴中恒溫反應30 min，取出室溫下平衡10 min，于765 nm波長處測定其吸光度。用去離子水代替樣品為空白，平行測定三次，取平均值。以沒食子酸質量濃度X(mg/L)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制多酚標準曲線，如圖1所示。經計算機線性回歸計算，得回歸方程A=0.037 74X+0.018 86，線性相關系數r為0.999 3，表明沒食子酸在質量濃度1.96～15.68 mg/L，濃度與其在765 nm波長處的吸光度線性關系良好，該標準曲線方程可用于貓爪草中多酚含量測定。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.3 貓爪草中多酚含量的測定

準確稱取粉碎后的貓爪草1 g，按設定的料液比加入一定濃度的乙醇，在恒定溫度下浸提一段時間，過濾，將濾液定容至50 mL，取待測液2 mL于25 mL比色管中，按2.2中的方法測定其吸光度，通過以下公式計算貓爪草中多酚浸出量。

式中c為標準曲線回歸方程計算出的多酚質量濃度(mg/L)；v為反應體系總體積(mL)；ms為干樣品質量(g)；n為稀釋倍數。

2.4 貓爪草中多酚提取工藝單因素實驗設計

準確稱取貓爪草樣品1 g，以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個單因素設置5個水平點，平行測定每個因素每個水平點的吸光度，確定貓爪草中多酚的最佳提取工藝。單因素實驗設計見表1。

表1.單因素實驗設計Tabel 1.design of single factor experiment

3 結果與分析

通過乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，以貓爪草中多酚浸出量為指標，確定貓爪草中多酚的最佳提取工藝。

3.1 乙醇濃度

設定提取溫度為60℃、提取時間2 h，料液比1:30(g/mL)，以乙醇濃度分別為30%、45%、60%、75%、90%進行平行試驗，按2.2中的方法測定其吸光度，并計算多酚浸出量，結果見圖2。

圖2 乙醇濃度對多酚提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenols extraction

由圖2可知，隨著乙醇濃度逐漸增大，貓爪草中多酚浸出量也逐漸增高，當乙醇濃度為75%時，多酚浸出量達到最大，之后隨著乙醇濃度增大，多酚浸出量呈下降趨勢。產生這一現象的原因可能與貓爪草中多酚的極性有關，當乙醇濃度為75%時，其極性與多酚的極性相近，利于貓爪草中多酚的有效溶出；而當繼續增大乙醇濃度，貓爪草中部分脂溶性物質溶出，抑制了多酚的浸出，由此確定75%乙醇溶液提取貓爪草中多酚類物質的效果較為適宜。

3.2 料液比

固定乙醇濃度為75%，提取溫度為60℃、提取時間為2 h，以料液比分別為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 (g/mL)進行平行試驗，按2.2中方法測定其吸光度，并計算多酚浸出量，結果見圖3。

圖3 料液比對多酚提取的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on polyphenols extraction

由圖3所示，隨著料液比的增大，貓爪草中多酚浸出量逐漸增大，當料液比為1:50 (g/mL)時，多酚浸出最多，之后再繼續增大料液比，多酚浸出反而下降，這可能是因為在料液比為1:50 (g/mL)時已將貓抓草中絕大部分多酚類物質溶出，因此從節約溶劑量降低成本考慮，確定貓爪草中多酚的最佳提取料液比為1:50 (g/mL)。

3.3 提取時間

固定乙醇濃度為75%、料液比為1:50 (g/mL、提取溫度為60℃，以提取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h平行進行提取，按2.2中方法測定其吸光度，并計算多酚浸出量，結果見圖4。

圖4 時間對多酚提取的影響Fig.4 Effect of time on polyphenols extraction

從圖4可以看出，隨著浸提時間的延長，貓爪草中多酚類物質的浸出量逐漸增加，在1.5 h時達到最大，1.5 h后隨時間延長多酚浸出量變化不明顯。這或許是由于浸提1.5 h后，貓爪草中多酚類物質的浸出量已幾近飽和，溶液中多酚含量不隨時間的延長而增加，并且長時間浸提，多酚類物質會因光、熱、氧的作用，穩定性降低，發生降解，導致浸出量減少，所以，出于對節省工藝時間的考慮，確定最佳浸提時間為1.5 h。

3.4 提取溫度

固定乙醇濃度為75%、料液比為1:50、提取時間1.5 h，分別以溫度為40、50、60、70、80℃5個水平點平行進行提取，按2.2中方法測定其吸光度，并計算多酚浸出量，結果見圖5。

圖5 溫度對多酚提取的影響Fig.5 Effect of temperature on polyphenols extraction

從圖5可以看出，在40～70℃，隨著浸提溫度的升高，貓爪草中多酚的浸出量明顯增大，70℃時達到最大，多酚浸出量為251.4μg/g；當浸取溫度超過70℃后，多酚浸出量有所下降，其原因可能是在40～70℃時，隨著溫度的升高，分子擴散速度加快，有助細胞內多酚類物質的溶解，當溫度高于70℃后，一方面由于乙醇揮發，乙醇濃度降低，多酚浸出量減少，另一方面溫度高于70℃，一些熱敏性的多酚類物質發生分解，含量下降，綜上原因，可確定貓爪草中多酚的最佳浸提溫度為70℃。

4 結論與討論

植物多酚是植物體內含有多個酚羥基的化合物，具有抑制腫瘤、抗病毒、抗誘變、抗氧化、抗菌、消炎、鎮痛等功效[8,9]。目前，貓抓草中多酚類有效成分的優化提取工藝鮮有報道[2]。本文采用單因素實驗考察了乙醇濃度、料液比、時間、溫度4個因素對貓爪草中多酚浸出量的影響，初步確定了最佳提取工藝為：乙醇濃度75%、料液比1:50(g/mL)、浸提時間1.5 h、浸提溫度70℃，在此條件下，貓爪草中多酚的浸出量為251.4μg/g。福林酚比色法測定多酚，受顯色溫度，顯色時間，測定波長等多種因素的影響，因此在測定時應控制實驗條件在同一水平上平行操作，減少上述因素對貓爪草中多酚測定結果的影響。該實驗僅為貓抓草中多酚類物質提取的初步研究，在此實驗基礎上，還可以探究不同溶劑、不同提取方法及不同顯色方法對貓爪草中多酚測定的影響[10,11]，為貓爪草的綜合開發利用提供更充分的實驗依據。