基于UPLC-MS/MS測定烘焙咖啡豆中美拉德產物F3-A含量

王東旭，胡奇杰，王鳳麗，王新財，厲芬，陳褚建

(湖州市食品藥品檢驗研究院，浙江 湖州，313000)

美拉德反應(Maillard reaction)是一種在食品熱加工和貯藏過程中廣泛存在的非酶褐變反應，主要是指食品中的羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間發(fā)生的復雜反應，又稱羰胺反應[1]。隨著美拉德反應的進行，會產生一系列復雜的化合物，稱為美拉德反應產物(Maillard reaction products，MRPs)。MRPs廣泛存在于各種食品體系中，對食品的色澤、風味、穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值具有很大的影響[2-3]。[5-(5,6-dihydro-4H-pyridin-3-ylidenemethyl)-furan-2-yl]methanol，簡稱F3-A，是葡萄糖-賴氨酸反應模型中發(fā)現的一個美拉德反應產物[4-7]。藥理實驗研究顯示，F3-A在細胞因子誘導的Caco-2細胞中對NO及誘導性NO合成酶具有明顯的抑制作用，是一種潛在的預防腸道炎癥活性物質[8]。Caco-2細胞滲透性實驗表明，F3-A還具備較好的滲透性，同時由于F3-A具備良好的水溶性，其具有較高的生物利用度，因此有望在體內發(fā)揮抗炎作用[9]。

F3-A作為美拉德反應模型產物，主要由葡萄糖脫水形成的5-羥甲基糠醛與賴氨酸經Strecker降解、脫水環(huán)化形成的2,3,4,5-四氫吡啶發(fā)生縮合反應形成[9]。但其在真實食品中的研究還較少，目前文獻報道只在烘焙面包中檢出[9]，在其他食品中的研究還未見報道。

咖啡中含有大量的活性成分，具有減肥、提神醒腦、利尿、抗氧化等保健功效[10-12]，其中綠原酸[13-14]、咖啡因[15-17]、葫蘆巴堿[16-19]等已得到較多研究，但烘焙咖啡豆中F3-A含量的檢測尚未見報道。基于對F3-A的生成機理分析，咖啡生豆中含有約60%糖類物質和0.6%賴基酸[20]，在烘焙環(huán)境下，推測烘焙咖啡豆中會有F3-A生成。同時目前關于F3-A的檢測方法主要為液相色譜法[9]，該法具有對復雜基質分離要求較高，檢出限相對較高等不足。超高效液質聯用法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)作為一種集液相色譜的高分離效能與質譜的強鑒定能力于一體的檢測技術，具有適用范圍廣、靈敏度高、重復性好的特點，因而開發(fā)針對烘焙咖啡豆中F3-A的液質聯用方法對于探究F3-A在咖啡豆中的存在與否具有重要意義，此項研究同時有助于開發(fā)咖啡的潛在藥用價值和經濟價值。

本研究以5種咖啡豆(分別產自洪德拉斯、肯尼亞、印尼、巴西和薩爾瓦多)為原料，經過不同程度(輕度、中輕度、中度、中深度、重度和重深度)的烘焙，采用UPLC-MS/MS法檢測F3-A含量。通過分析F3-A含量變化，揭示不同烘焙時間、溫度對不同品種咖啡豆F3-A成分的影響，為調控烘焙咖啡豆中F3-A含量、提高咖啡藥用價值提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準品： [5-(5,6-dihydro-4H-pyridin-3-ylidenemethyl)-furan-2-yl]methanol(F3-A)，按參考文獻 [6]合成，結構經紅外譜圖和質譜確證，經高效液相色譜峰面積歸一化法定量測定，純度>95%；甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)、氨水(分析純，質量分數25%～28%)，上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸(分析純，質量分數36.0%～38.0%)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；Waters Oasis MCX(混合型強陽離子交換反向吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)、Waters Oasis WCX(混合型弱陽離子交換反相吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)、Waters Oasis HLB(全能型親水親脂平衡反相吸附劑)固相萃取小柱(60 mg，3 mL)，美國Waters公司；試驗用水為超純水。

咖啡原料：洪德拉斯SHB咖啡豆，產自洪都拉斯NINFA LANZA莊園；肯尼亞AA++咖啡豆，產自肯尼亞奇雅瓦姆魯魯；印尼羅布斯塔咖啡豆，產自印度尼西亞爪哇；巴西喜拉多咖啡豆，產自巴西喜拉多；薩爾瓦多紅波旁咖啡豆，產自薩爾瓦多Loma La GIoria莊園。

ACQUITYTM 超高效液相色譜、XevoTMTQD三重四極桿串聯質譜儀，美國Waters公司；ME204E型電子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；Genius 3漩渦混合器，德國IKA公司；KB-5010型試管振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-500DB型超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Allegra X-12R型臺式冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；12孔固相萃取儀，美國Supelco公司；Turbovap LV型多樣品自動濃縮儀，瑞典Biotage公司；Simplicity型超純水儀，美國MilliPore公司；L9/11/B410型馬弗爐，德國Nabertherm公司；JFSD-100型粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備

準確稱取F3-A標準物質適量，用甲醇溶液配制成質量濃度為1.00 mg/mL儲備溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。根據需要移取標準儲備溶液，經初始流動相溶液配制成質量濃度分別為5、10、50、100、500和1 000 ng/mL的標準工作溶液。取1.00 mL標準溶液經0.22 μm有機相濾膜過濾后供UPLC-MS/MS檢測。

1.2.2 供試品溶液的制備

隨機選取咖啡豆平鋪一層于坩堝盤中，放入馬弗爐固定位置烘焙。設定烘焙溫度為220 ℃，烘焙時間分別為10、20、30、40、50和60 min，烘焙完成后，立即取出冷卻至室溫。參照文獻[18]按咖啡豆爆裂程度定義為輕度(一爆密集爆)、中輕度(一爆尾爆)、中度(一爆結束二爆前)、中深度(二爆初爆)、重度(二爆密集爆)、重深度(二爆尾爆)。收集烘焙咖啡豆樣品，用粉碎機將咖啡豆粉碎(粒徑1.00 mm)，供含量測定。

稱取1.00 g(精確至0. 01 g)咖啡豆粉置于15 mL離心管中，加入10.00 mL 1 mol/L HCl溶液，渦旋2 min，超聲20 min，以9 000 r/min離心5 min，取上清液5.00 mL過固相萃取小柱(依次用3.00 mL甲醇和3.00 mL水活化)，經3.00 mL水和3.00 mL甲醇淋洗，6.00 mL 體積分數5%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液于試管中，40 ℃下氮吹至近干，加入1.00 mLV(甲醇)∶V(0.1%甲酸水溶液)=5∶95混合溶液復溶，混勻，過0.22 μm有機濾膜。按儀器工作條件進行測定。

1.3 測定方法

分別精密吸取上述不同濃度對照品溶液各5.00 μL，注入高效液相串聯質譜儀，測定出峰面積，以質量濃度(ng/mL)(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制F3-A化合物標準曲線圖。精密吸取上述供試品溶液5.00 μL，注入高效液相串聯質譜儀，測定峰面積，采用外標法定量。

1.4 色譜及質譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為甲醇溶液，流動相B為體積分數0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，5%A；1.0～2.0 min，5%～50%A；2.0～3.0 min，50%～95%A；3.0～4.0 min，95%A；4.0～4.1 min，95%A～5%A；4.1～7.0 min，5%A；流速0.30 mL/min；進樣體積5.00 μL；柱溫40 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)電離，正離子多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式檢測；毛細管電壓為5.0 kV；離子源和脫溶劑氣溫度分別為150和350 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣流速分別為800和50 L/h；碰撞氣為氬氣；F3-A的定性定量離子對(m/z)、錐孔電壓及碰撞能量等質譜參數見表1。

表1 F3-A的監(jiān)測離子對及最佳質譜參數Table 1 Selected transitions and optimized potentials of F3-A

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

由于咖啡豆基質較為復雜，采用振蕩提取和液液萃取作為提取和純化方法提取效率不高，純化效果不佳[9]。因此本研究分別對提取和純化方式進行了優(yōu)化。在其余條件完全一致情況下，分別采用振蕩提取20 min和超聲20 min,考察2種方式的提取效率。結果表明，超聲提取得到的目標物響應面積較振蕩高(15.2±1.3)%，故確定超聲20 min作為最佳提取方法。其次考察了各種固相萃取小柱的純化效果，由于F3-A為弱堿性，本研究選取了Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis WCX 3種相同品牌及規(guī)格，但不同填料類型的固相萃取小柱進行純化優(yōu)化，如圖1所示。結果顯示，WCX和MCX均能有效地對F3-A進行富集及純化，其中MCX的富集及純化效果最佳，而HLB則較難在柱中保留，故最終選取MCX作為最優(yōu)固相萃取小柱。

圖1 固相萃取小柱優(yōu)化Fig.1 Optimization of solid phase extraction column

2.2 標準曲線、線性范圍和檢出限

將F3-A對照溶液在上述液相質譜條件下進行測定，繪制進樣濃度為橫坐標、定量離子對峰面積為縱坐標的F3-A化合物標準曲線，線性擬合得到線性方程和決定系數，結果見表2。F3-A線性擬合良好，決定系數達到0.999。F3-A對照品溶液色譜圖及陽性樣品色譜圖見圖2。F3-A峰形良好，目標峰周圍無雜峰干擾，滿足定量檢測要求。根據信噪比(S/N)=3，采用不含F3-A的空白基質樣品提取液逐級稀釋F3-A標準溶液分析得到檢出限。

表2 回歸方程和線性范圍Table 2 Linearity Parameter and linear range of F3-A

a-F3-A標準溶液色譜圖(10 ng/mL)；b-陽性樣品色譜圖圖2 F3-A標準溶液色譜圖和陽性樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms for the standard solution of F3-A and the positive sample

2.3 回收率和精密度實驗

在咖啡豆樣品中分別加入3個濃度梯度的F3-A標準溶液，按上述條件平行測定6次，扣除本底含量后計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表3。采用該方法測定F3-A的加標回收率為85.7%～93.3%，相對標準偏差為2.56%～3.97%。F3-A化合物精密度和回收率均滿足定量檢驗需求。

表3 F3-A精密度與回收試驗結果(n=6)Table 3 Test results for recovery and precision(n=6)

2.4 烘焙咖啡豆F3-A含量檢測及調控

基于新建立的咖啡豆中F3-A的液質聯用檢測方法，在220 ℃下對5種咖啡生豆中F3-A含量進行了測定，結果見圖3。未烘焙情況下，5種咖啡生豆中均未檢出F3-A，隨著烘焙條件的加入，正如之前推測，5種咖啡豆中均檢測出F3-A，隨著烘焙時間的增加，F3-A的含量先升高再下降，烘焙10 min時，除了薩爾瓦多紅波旁咖啡豆，其余4種咖啡豆中F3-A含量達到峰值，肯尼亞AA++咖啡豆含量最高達到297.5 μg/kg。烘焙時間繼續(xù)增加，F3-A含量則逐漸下降，烘焙時間達到40 min時，5種烘焙咖啡豆中F3-A含量不再檢出。因此，確定10 min為最佳咖啡豆烘焙時間。

圖3 五種咖啡豆不同烘焙時間下的F3-A含量變化(n=3)Fig.3 F3-A content of 5 coffee beans with different roasting time (n=3)

不同烘焙溫度下烘焙10 min后對5種咖啡豆中F3-A的含量進行測定，結果見圖4。不同烘焙溫度下F3-A含量差異較大， 200 ℃時，5種咖啡豆中F3-A含量達到峰值，洪都拉斯SHB和肯尼亞AA++咖啡豆含量最高，分別達到了318.1和329.5 μg/kg，溫度繼續(xù)增高會造成F3-A含量下降。因此最終確定咖啡豆最佳烘焙溫度為200 ℃。

圖4 五種咖啡豆不同烘焙溫度下的F3-A含量變化(n=3)Fig.4 F3-A content of 5 coffee beans with different roasting temperature (n=3)

結合不同溫度和不同時間下F3-A含量比對發(fā)現，二者之間存在交叉影響，咖啡豆在240 ℃烘焙10 min與220 ℃下烘焙30 min兩種模式下，F3-A含量接近，表明低溫長時烘焙和高溫短時烘焙具有類似的烘焙效果，其原因推測為F3-A分解速率受溫度因素影響所致，在較高溫度下F3-A分解越快，較低溫度下F3-A含量維持更久。

3 結論

本文建立了以UPLC-MS/MS檢測咖啡豆中F3-A含量的檢測方法，采用鹽酸溶液提取、MCX固相萃取小柱純化，在MRM模式下檢測，外標法定量。該分析方法靈敏度好、準確度高、實用性強，其中檢出限為1.0 μg/kg，遠低于已報道[9]的21.0 μg/kg，為咖啡豆中F3-A含量檢測尤其是痕量檢測提供了技術支持。本文首次發(fā)現了烘焙咖啡豆存在美拉德產物F3-A，且F3-A含量與烘焙條件和咖啡豆品種密切相關。不同烘焙溫度及時間下，5種咖啡豆中F3-A含量測定結果顯示，輕度烘焙時F3-A含量普遍較高，最優(yōu)烘焙條件為200 ℃下烘焙10 min。肯尼亞AA++咖啡豆較其他4種咖啡豆中生成F3-A含量更高，達到329.5 μg/kg。與文獻[9]報道烘焙面包中F3-A的最高含量(177 μg/kg)相比，烘焙咖啡豆中F3-A含量更高，更具有潛在的藥用價值。