基于blaCARB-17基因建立水產品中副溶血弧菌的環介導等溫擴增技術檢測方法

胡元慶，沈子晨，李鳳霞，呂琳雪，周贊虎

1(閩南師范大學 生物科學與技術學院，福建 漳州，363000)2(揚州大學，江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州，225000)3(漳州海關綜合技術服務中心，福建 漳州，363000)

水產品食物中毒主要由副溶血弧菌引起，給人們的健康帶來嚴重威脅[1]，同時也給物聯網趨勢下的食品安全帶來挑戰[2]。因處理不當使不同類型的水產品發生細菌交叉污染，食用后有可能導致食物中毒[3]，急性發作、嘔吐、腹痛、腹瀉及水樣便是主要臨床表現[4]。副溶血弧菌在食品環境中受到多種抗生素壓力而產生耐藥性，如鏈霉素、氨芐青霉素和頭孢類，長期處于該環境可產生大量的多重耐藥菌株[5-6]。建立針對副溶血弧菌快速檢測技術是預防及控制該菌的關鍵。

傳統微生物培養法是檢測食源性病原菌的“金標準”，但其耗時長(一般4～7 d)、程序繁雜、工作量較大，難以滿足快速檢測的實際需求。目前，檢測副溶血弧菌的分子方法有常規PCR法[7-8]、實時熒光定量PCR[9-10]和酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等[11]。這些技術已得到廣泛應用，但因儀器價格昂貴，難以開展現場檢測。環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種在恒溫條件下使DNA大量擴增的新技術，其針對靶序列的6個特定區域，設計4條特異性引物，通過BstDNA聚合酶的鏈置換和鏈延伸作用實現擴增[12]。與常規PCR和實時熒光定量PCR技術相比，LAMP具有更高的靈敏性和特異性，且不需要特殊儀器，能在1 h內獲得足量目的DNA用于分析[13]。基于以上優勢，LAMP適合現場快速檢測病原菌。近年來，全球學者報道了用于檢測副溶血弧菌的LAMP方法。YAMAZAKI等[14]于2008年以tlh基因為檢測位點首次建立了副溶血弧菌的LAMP技術，最低檢測限可達5.3×102CFU/mL。后來建立了針對副溶血弧菌toxR基因的LAMP方法[15]。這些方法不能用于鑒別致病性菌株，于是建立了針對毒力基因tdh和trh的LAMP方法[16]。學者根據檢測需要也建立了多重LAMP[16-17]、原位LAMP[18]、多重核酸內切酶限制實時LAMP[19]、LAMP-LFD(loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick)[20]和微流體LAMP[21]等技術。國內學者也建立了針對副溶血弧菌tlh[22-23]、tdh[24]、trh[24]、ompA[25]和toxR[26]等基因的LAMP技術。

近年來，通過副溶血弧菌比較基因組學的研究，發現一種新的分子遺傳標記。CHIOU等[27]于2015年報道了副溶血弧菌的青霉素耐藥性源于一種β內酰胺酶編碼基因-17(class A carbenicillin-hydrolyzing β-lactamase family-17,blaCARB-17)，在GenBank的293株副溶血弧菌和91株食品分離株中均發現該基因。LI等[28]在2016年證明副溶血弧菌的blaCARB-17是一種高特異的遺傳學標記，相對于tlh、atpA更為保守，特異性更高[29]，而針對tlh和atpA基因的PCR檢測會出現假陽性[28]。本研究基于副溶血弧菌新的特異性靶點blaCARB-17建立并優化LAMP擴增體系和條件，探究其特異性、靈敏性和可靠性，以滿足水產品現場高效快檢的實際需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusATCC17802)、志賀氏菌(ShigellaB4)、大腸桿菌(EscherichiacoliD5)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC26003)、沙門氏菌(Salmonellaenteritidis50041)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes54001)由漳州海關綜合技術服務中心微生物檢測室惠贈，在生物科學與技術學院實驗室保存。

主要試劑：BstDNA聚合酶大片段、100 mmol/L MgSO4、6×Loading Buffer、Gel Stain(10 000×)核酸染料、dNTP、10×反應緩沖液、Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker，北京全式金生物科技有限公司；GK1071細菌基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)、SYBR Green I，上海捷瑞生物工程有限公司；TCBS培養基、3%氯化鈉堿性蛋白胨水，青島高科園海博生物技術有限公司；營養瓊脂、LB培養基，北京陸橋技術股份有限公司。

主要儀器：UV超靈敏多功能成像儀(Amersham Imager 600)，美國通用電氣公司；高速離心機(MIKRO120)，德國Hettich公司；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R)、隔水式恒溫培養箱(GSP-9050MBE)，上海博迅實業有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-IFD)，蘇州安泰空氣技術有限公司；電泳儀(Power B)，北京凱元信瑞儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋(HH-2)，常州國華電器有限公司；恒溫振蕩搖床(HQY-C)，金壇市鴻科儀器廠；超微量分光光度計(Nanodrop One)，基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板的制備

副溶血弧菌標準株ATCC17802劃線于TCBS固體培養基上，37 ℃培養得到單菌落。挑取單菌落到3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，200 r/min振蕩培養得到菌懸液。取1 mL菌懸液，以12 000 r/min離心2 min收集菌體，沉淀按照GK1071細菌基因組DNA快速提取試劑盒操作說明提取DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

選擇副溶血弧菌blaCARB-17基因為目標序列，用Primer Explorer V4軟件(http://primerexplore-r.jp/e/)，在線設計LAMP的內引物FIP、BIP和外引物F3、B3，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。tlh基因引物參考文獻[7]設計，擴增片段長度約為450 bp。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 擴增反應體系

1.3.1 LAMP擴增體系

反應體系(25 μL)：50 mmol/L MgSO4(2.4 μL)，10 mmol/L dNTPs (3.6 μL)，10×反應緩沖液(2.5 μL)，10 μmol/L F3和B3(各0.5 μL)，10 μmol/L FIP和BIP (各4 μL)，DNA模板(1 μL)，8 U/μLBstDNA聚合酶(1 μL)，無菌雙蒸水(ddH2O)補足25 μL，混勻。在63 ℃水浴鍋中反應60 min，80 ℃、20 min酶滅活結束反應。取4 μL產物在質量濃度20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳檢測，同時加1 μL SYBR Green Ⅰ(1 000×)至反應管中肉眼觀察顏色變化。

1.3.2 PCR擴增體系

反應體系(25 μL)：2×PowerTaqPCR Master Mix預混液(12.5 μL)，L-tlh和R-tlh引物(各1 μL)，副溶血弧菌DNA模板(3 μL)，用ddH2O補齊25 μL。擴增程序：94 ℃、3 min預變性；94 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，25次循環；72 ℃延伸10 min。取5 μL產物在質量濃度15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分析。

1.4 LAMP體系的優化

對BstDNA聚合酶量、內外引物濃度比、dNTPs濃度、Mg2+濃度、反應溫度和反應時間分別進行優化，參數設計見表2。對某一條件優化時，其他參數按照1.3.1小節進行。

表2 LAMP體系中參數優化的試驗設計Table 2 Design of parameter optimization in LAMP system

1.5 特異性試驗

以單核細胞增生李斯特菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌作為對照，先分別得到液體培養物，用試劑盒提取各自基因組DNA，然后各取1 μL DNA模板加入已優化的LAMP反應體系進行檢測，分析LAMP檢測副溶血弧菌的特異性。

1.6 靈敏性試驗

將副溶血弧菌ATCC17802按照1.2.1小節的方法制備基因組DNA模板，然后用Nanodrop超微量分光光度計測定其初始濃度，倍比稀釋得到不同濃度的DNA模板。分別取1 μL模板溶液加入已優化的反應體系進行LAMP擴增，電泳與SYBR Green Ⅰ染料分析，確定其靈敏度。

1.7 人工污染模擬試驗

將副溶血弧菌ATCC17802液體擴大培養，利用平板計數法調整菌懸液濃度為1×107CFU/mL，并進行10倍梯度稀釋，使菌懸液濃度為1～1×107CFU/mL，取1 mL菌液分別均勻涂布于新鮮蝦樣品表面，室溫放置4 h后，用1 mL ddH2O沖洗回收菌液，用1.2.1小節的方法提取基因組DNA。各取1 μL DNA模板加入已優化的反應體系進行LAMP擴增，得出人工污染樣品的檢測限。

1.8 實際樣品檢測

采集水產市場新鮮花蛤、牡蠣和蝦樣品共144份，通過國標方法分離鑒定副溶血弧菌，并用常規PCR技術檢測分離株的tlh基因。對陽性樣品用無菌ddH2O回收菌體，提取基因組后用優化的LAMP技術進行檢測，分析其可靠性。

2 結果與分析

2.1 LAMP體系的建立

本試驗針對副溶血弧菌blaCARB-17基因設計一套特異性引物進行LAMP擴增。圖1-a所示為電泳檢測結果，陰性對照的擴增產物未顯示階梯狀條帶，副溶血弧菌ATCC17802的DNA擴增產物顯示階梯狀條帶；圖1-b所示為SYBR Green Ⅰ染色檢測結果，副溶血弧菌ATCC17802的DNA擴增產物變熒光綠，陰性對照管為橘黃色。結果表明，建立的LAMP體系能正確擴增目的基因，用于檢測副溶血弧菌。

a-LAMP產物電泳檢測；b-LAMP產物SYBR Green Ⅰ染色檢測；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2-副溶血弧菌ATCC17802標準株基因組圖1 副溶血弧菌ATCC17802標準株LAMP結果Fig.1 Results of LAMP detection of Vibrio parahaemolyticus standard strain ATCC17802

2.2 LAMP各主要參數的優化

2.2.1 優化Mg2+濃度

本實驗對LAMP反應體系中1.2～7.2 mmol/L遞增濃度的Mg2+進行了考察。如圖2-a所示，陰性對照和濃度為1.2 mmol/L的Mg2+沒有階梯狀條帶產生；其余的反應管均顯示階梯狀條帶，電泳條帶清晰度和亮度最佳的Mg2+濃度為2.4 mmol/L。如圖2-b所示，橘黃對應的為陰性對照管和Mg2+濃度為1.2 mmol/L的反應液，其余反應液均為熒光綠。圖2-b中的樣品6和7顏色稍深，與圖2-a中對應的電泳結果一致。因為BstDNA酶是一種Mg2+依賴性聚合酶，適量Mg2+濃度可促進酶的反應活性。由圖2可見，Mg2+濃度為2.4 mmol/L時擴增產物量最多，隨其濃度升高，DNA量反而下降。結果表明,25 μL體系中50 mmol/L MgSO4溶液最佳添加量為1.2 μL，即濃度為2.4 mmol/L，比胡元慶等[22]研究的3.6 mmol/L Mg2+濃度略低，比紀懿芳等[23]研究的4.0 mmol/L Mg2+濃度也低。

a-Mg2+濃度對LAMP影響的電泳結果；b-Mg2+濃度對LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～7-體系中Mg2+濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mmol/L圖2 Mg2+濃度對LAMP反應的影響Fig.2 Effect of Mg2+ concentration on LAMP reaction

2.2.2 優化dNTPs濃度

dNTPs是LAMP擴增產生DNA鏈的原料，其濃度與反應的效率密切相關，決定產物的最終合成量。本實驗對LAMP反應體系中0.64～1.76 mmol/L遞增濃度的dNTPs進行考察。由圖3-a可知，除了陰性對照管無階梯狀條帶，其余所有濃度dNTPs均產生了階梯狀條帶；最清晰的dNTPs濃度為0.96 mmol/L。SYBR Green Ⅰ檢測結果如圖3-b所示，橘黃色對應陰性對照反應管，熒光綠為所有實驗組反應管。

a-dNTPs濃度對LAMP影響的電泳結果；b-dNTPs濃度對LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～9-體系中dNTPs濃度分別為0.64、0.8、0.96、1.12、1.28、1.44、1.6和1.76 mmol/L圖3 dNTPs濃度對LAMP反應的影響Fig.3 Effect of dNTPs concentration on LAMP reaction

由于dNTP能與游離的Mg2+結合，在LAMP體系中過量時可以間接影響BstDNA酶的活性。所以圖3-a中樣品8的dNTP濃度為1.6 mmol/L，DNA合成量明顯下降。綜上所述，0.96 mmol/L的dNTPs為25 μL體系中的最佳濃度，與胡元慶等[22]篩選的最佳dNTPs條件一致，但比紀懿芳等[23]研究的3.5 mmol/L dNTPs濃度低很多。

2.2.3 優化BstDNA聚合酶量

BstDNA聚合酶是LAMP反應的催化劑，可直接影響擴增效率。本實驗考察了BstDNA聚合酶用量對LAMP反應的影響。如圖4-a所示，酶的用量為0和1.6 U時無階梯狀條帶出現；3.2 U時開始產生階梯狀條帶，4.8 U時產生最清晰條帶，繼續增加酶用量至6.4 U產物量無顯著增加，當達到8 U時產物量反而下降。分析原因可能是高濃度的酶量會增加引物多聚體之間發生錯配的幾率，影響LAMP擴增的效率。如圖4-b所示，橘黃色對應陰性對照管和BstDNA聚合酶量為0和1.6 U時反應管，其余反應液均為綠色，而樣品7顏色稍深，與高酶量時擴增效率下降有關。另外BstDNA聚合酶用量直接決定檢測成本。綜上所述，4.8 U為25 μL體系中BstDNA聚合酶(8 U/μL)的最佳用量，與胡元慶等[22]篩選的最佳酶量條件一致。

a-Bst DNA聚合酶用量對LAMP影響的電泳結果；b-Bst DNA聚合酶用量對LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～7-體系中Bst DNA聚合酶量分別為0、1.6、3.2、4.8、6.4和8 U圖4 Bst DNA聚合酶量對LAMP反應的影響Fig.4 Effect of the amount of Bst DNA polymerase on LAMP reaction

2.2.4 優化內外引物濃度比

內外引物濃度比是影響LAMP反應特異性的重要條件。本實驗考察內外引物濃度比對LAMP反應的影響。如圖5-a所示，所有濃度比都出現階梯狀條帶，當內外引物濃度比為8∶1時，階梯狀最清晰，繼續增加引物比DNA產量略有下降。如圖5-b所示，橘黃色對應陰性對照管反應液，熒光綠色為實驗組反應液。LAMP反應中內引物不斷被消耗，而外引物量不會減少，所以內外引物比越來越小，會抑制內引物與靶序列配對，導致反應不徹底。綜上所述,內外引物濃度比8∶1為25 μL體系中最佳條件，與胡元慶等[22]和紀懿芳等[23]篩選的最佳引物比均一致。

a-內外引物濃度比對LAMP影響的電泳結果；b-內外引物濃度比對LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～6-體系中內外引物濃度比分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1圖5 內外引物濃度比對LAMP反應的影響Fig.5 Effect of the ratio of primer concentration on LAMP reaction

2.2.5 優化反應時間

LAMP相對于PCR擴增技術而言，沒有升溫和降溫的過程，所以顯著節省了反應時間。本實驗考察反應時間對LAMP反應的影響。由圖6-a可知，清晰的階梯狀條帶開始產生的反應時長為40 min；反應時間最短，產生亮度和清晰度最佳的階梯狀條帶的時長為60 min。如圖6-b所示，橘黃色為陰性對照管反應液，其余反應液為熒光綠色。從時間優化的結果分析，到達60 min時擴增基本進入平臺期，時間繼續延長并不能顯著增加DNA的產量，本著節約時間提高效率的原則，選擇60 min作為最佳條件，與胡元慶等[22]和紀懿芳等[23]篩選的最佳反應時間均一致。

a-反應時間對LAMP影響的電泳結果；b-反應時間對LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～7-體系中反應時間分別為20、30、40、50、60和70 min圖6 反應時間對LAMP反應的影響Fig.6 Effect of reaction time on LAMP

2.2.6 優化反應溫度

LAMP是一種酶促反應，溫度是控制酶活性的關鍵因素。本實驗考察溫度對LAMP反應的影響。由圖7-a可知，在57～67 ℃時均有階梯狀條帶產生，當反應溫度為65 ℃時擴增條帶最清晰，溫度達到67 ℃時DNA產量略有下降。如圖7-b所示，橘黃色為陰性對照管反應液，其余反應液為熒光綠。BstDNA聚合酶最適反應溫度是60～65 ℃，在此條件下酶兼具雙鏈解離與新鏈延伸的雙重活性，溫度過高可導致引物無法與目的片段有效結合而影響擴增效率，溫度過低可使引物之間形成多聚體或者錯配，出現假陽性結果。結果表明，65 ℃為25 μL體系中最佳反應溫度，比胡元慶等[22]篩選的最佳反應溫度63 ℃稍高，與紀懿芳等[23]研究的最佳反應溫度一致。

a-反應溫度對LAMP影響的電泳結果；b-反應溫度對LAMP影響的SYBR Green I染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～7-體系中反應時間分別為57、59、61、63、65和67 ℃圖7 反應溫度對LAMP反應的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on LAMP

2.3 特異性結果

特異性是評價LAMP反應可靠性的重要指標。結果如圖8-a所示，階梯狀條帶產生的為副溶血弧菌標準菌株ATCC17802，其余5株非副溶血弧菌均未出現階梯狀條帶。如圖8-b所示，用SYBR Green Ⅰ檢測，反應液熒光綠的為溶血弧菌標準菌株基因組，其余5株非副溶血弧菌反應液為橘黃色。影響LAMP特異性的因素很多，其中引物序列、內外引物比和BstDNA聚合酶用量直接影響特異性，而Mg2+濃度、dNTPs濃度、反應時間和溫度則間接影響特異性。本實驗對以上各因素確定了最佳條件后，用5種常見的食源性病原菌作對照分析LAMP方法檢測副溶血弧菌的特異性，為實際應用于食品安全檢測奠定基礎。結果表明，用新的靶基因blaCARB-17建立的LAMP方法具有很好的特異性。

a-特異性實驗的電泳結果；b-特異性實驗的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1，7-副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)；2～6-分別是大腸桿菌(Escherichia coli D5)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)、沙門氏菌(Salmonella enteritidis 50041)、志賀氏菌(Shigella B4)、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes 54001)圖8 LAMP的特異性結果Fig.8 Results of LAMP specificity

2.4 靈敏性結果

LAMP反應的靈敏性是評價其實效性的一項重要指標。本實驗用試劑盒提取了副溶血弧菌ATCC17802基因組，梯度稀釋后作為LAMP反應的模板分析其靈敏性。由圖9-a可知，當基因組DNA質量濃度為3.64×102ng/μL時，電泳圖顯示有梯狀條帶，質量濃度繼續降低,條帶消失。SYBR Green I檢測結果如圖9-b所示，基因組質量濃度為3.64×102ng/μL時反應管顯示綠色，質量濃度繼續降低綠色變淡。綜合電泳和染料顯色結果：本實驗所建立的LAMP方法的最低檢測限為3.64×102ng/μL，比紀懿芳等[23]研究的最低檢測限高。

a-靈敏性實驗的電泳結果；b-靈敏性實驗的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～11-副溶血弧菌ATCC17802的DNA質量濃度依次為4.66×104、2.33×104、1.17×104、5.82×103、2.91×103、1.46×103、7.28×102、3.64×102、1.82×102和9.09×101 ng/μL圖9 LAMP的靈敏性結果Fig.9 Results of LAMP sensitivity

2.5 人工污染蝦樣品LAMP結果

副溶血弧菌ATCC17802的菌液梯度稀釋后，涂于新鮮蝦體表進行污染模擬。如圖10-a所示，所有污染菌液的樣品均有階梯狀條帶出現，陰性對照未出現階梯狀；用SYBR Green I染色檢測的結果如圖10-b所示，除了陰性對照管所有反應管變為綠色。

a-LAMP檢測人工污染蝦樣品電泳結果；b-LAMP檢測人工污染蝦樣品的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～8-副溶血弧菌ATCC17802的菌液濃度依次為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101 CFU/mL圖10 人工污染蝦樣品的LAMP結果Fig.10 Results of LAMP for detecting experimentally inoculated shrimp samples

結果表明：人工污染模擬實驗得到最低檢測限為10 CFU/mL，略高于胡元慶等[22]報道的1 CFU/mL，比紀懿芳等[23]的模擬實驗中最低檢測限2.8×102CFU/mL略低。

2.6 實際樣品檢測結果

用針對tlh基因的PCR技術在450 bp處出現單條帶(圖略)，鑒定副溶血弧菌分離株共33株；對33個陽性樣品(編號2～34)進行LAMP檢測，實驗結果均為階梯狀條帶，如圖11-a所示；用SYBR Green I檢測結果如圖11-b所示，反應液(編號2～34)均顯示熒光綠色。以上結果表明，建立的LAMP與tlh基因的PCR方法符合率100%。

a-LAMP檢測實際樣品實驗的電泳結果；b-LAMP檢測實際樣品實驗的SYBR Green Ⅰ染色結果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對照；2～34-實際樣品圖11 LAMP檢測實際樣品結果Fig.11 Results of LAMP for detecting aquatic products

3 討論

副溶血弧菌是河口和海洋環境的常駐菌，目前已成為水產食源性人類腸炎的主要病原[1]。該菌每年導致全球約50%-70%的腹瀉型腸炎病例，且引發的食物中毒事件越發頻繁[5]。從各種水產品的生產環境都能分離到該菌，且對鏈霉素、頭孢類和氨芐等抗生素表現高度耐藥性[3]。沿海地區的多重耐藥性在各種抗生素壓力環境中不斷演化[5]。副溶血弧菌對食品安全的威脅包括食物中毒、環境帶菌和多重耐藥3個方面。為防控該菌的傳播及變異，快速檢測是最有效的手段。

LAMP技術具有簡便、快速、易操作、不需要特殊擴增設備等優點[12]。LAMP沒有常規PCR的升溫和降溫循環，在恒溫箱或水浴鍋中63～65 ℃反應約30～60 min即得足量產物，更適合現場即時檢測[14]。分子診斷技術需要純化的DNA為模板，制備高純度DNA既耗時又費錢，而LAMP可用粗提的DNA為模板。LAMP在結果分析方面有明顯優勢，可用多種技術檢測產物，包括瓊脂糖凝膠電泳、肉眼可視化觀察、使用濁度計[29]。

本文對影響LAMP特異性與靈敏性的主要條件逐一進行了優化。其中BstDNA聚合酶用量、Mg2+濃度和反應溫度通過影響BstDNA聚合酶的活性而作用于催化反應，是LAMP的關鍵條件。BstDNA酶是LAMP反應中的重要因素，適當酶量可以保證反應順利進行，高濃度會使引物形成多聚體而降低反應效率[12]。Mg2+可對BstDNA聚合酶的活性產生影響，高濃度的Mg2+不僅增加反應的成本，還會導致體系的不穩定[23]。LAMP反應中Mg2+濃度有一個最佳條件，過多或過少都可能沒有結果。溫度是通過控制酶活性而影響LAMP反應[15]，溫度過高會使引物與目的片段結合效率降低，溫度過低可使引物形成多聚體而出現假陽性。內引物在LAMP反應中是決定因素，率先與靶序列互補配對，在BstDNA聚合酶作用下啟動鏈延伸[12]。而外引物遵循自由碰撞理論與靶序列配對，高濃度能提升其錨定靶基因的效率，為內引物的延伸提供骨架。適當濃度的dNTPs是擴增反應的原料保障，實驗中不宜過量，因為低濃度的dNTP可減少非靶位啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入[23]。LAMP相對于常規PCR和定量PCR技術的最大優勢是省時高效，一般反應在60 min內完成，借助染料或與流動試紙條(lateral flow dipstick, LFD)技術聯用可在1 h內得到結果。為確定新建立LAMP方法的可靠性，我們用新鮮蝦為宿主進行了模擬實驗，得到了最低檢測限為10 CFU/mL，為實際推廣應用提供參考。為進一步驗證LAMP的可靠性，本實驗收集了144份水產樣品，微生物分離后用PCR技術鑒定陽性菌株，用LAMP技術進行檢測，結果也證明所建方法實用可靠。

特異性是LAMP檢測技術的重要指標。本研究首次以副溶血弧菌的一種β內酰胺酶編碼基因blaCARB-17為靶序列建立LAMP。特異性實驗表明，本方法能特異性擴增副溶血弧菌ATCC17802的blaCARB-17基因，未檢出其他5個對照食源性細菌。blaCARB-17基因在探索副溶血弧菌對氨芐西林的耐藥機制時被發現，其位于基因組的2號染色體上，該基因的上游和下游分布相關的轉運蛋白和酶編碼基因[27]。blaCARB-17基因無法定位于任何基因島上，其遺傳環境中沒有整合酶和轉座酶等元件，表明該基因是副溶血弧菌的固有序列。2016年，LI等[28]基于blaCARB-17基因建立了檢測副溶血弧菌的PCR方法，特異性達到100%，而用tlh和atpA的PCR檢測有假陽性，充分證明該基因是副溶血弧菌新的特異性靶序列。近年來，國內外學者建立了檢測副溶血弧菌的多種LAMP方法，包括常規LAMP和LAMP與其他技術聯用，但均未能對實際樣品現場即時性檢測[29]。常規LAMP比其他技術更實用，影響因素較少。本研究首次以blaCARB-17為靶序列建立常規LAMP方法，為深入探索其可視化試劑盒提供依據。

靈敏度是檢測技術的另一項評價指標。本實驗得到基因組最低檢測限為3.64×102ng/μL，模擬實驗的菌落最低檢測限為10 CFU/mL。胡元慶等[22]建立了基于tlh基因的LAMP方法，最低檢測限為1 CFU/mL；紀懿芳等[23]建立了以tlh為標識基因的LAMP方法，最低檢測限為140 CFU/mL；周順等[25]建立了以ompA為靶基因的創傷弧菌和副溶血弧菌的雙重LAMP，對實際樣品檢測的靈敏度可達374～410 CFU/g (mL)；相興偉等[26]建立了針對副溶血弧菌toxR和霍亂弧菌ompW基因的雙重LAMP，對模擬食品樣品的最低檢測限為50 CFU/mL。通過以上對比可知,本研究建立的LAMP檢測限低于其他報道，可以用于水產食品的實際檢測。

4 結論

本研究針對副溶血弧菌blaCARB-17基因在線設計特異性引物，運用BstDNA聚合酶擴增β內酰胺酶基因，對反應體系中各項參數進行優化，確定了Mg2+的最適濃度為2.4 mmol/L，dNTPs的最佳反應濃度為0.96 mmol/L，BstDNA聚合酶最適用量為4.8 U，最佳內外引物濃度比是8∶1，最佳反應溫度是65 ℃，最佳反應時間60 min，首次以blaCARB-17為目標序列建立了檢測副溶血弧菌LAMP技術。在此基礎上，以單核細胞增生李斯特菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌為對照考察了LAMP的特異性，結果顯示只有副溶血弧菌LAMP反應呈陽性，其他對照菌株為陰性，表明該方法具有很好的特異性。通過模擬實驗和實際樣品的檢測，都能說明該LAMP方法具有很好的可靠性。當然本研究還有一些可以改進的方面，比如用羥基萘酚藍染料[29]代替SYBR Green I實現可視化，反應前加入可避免操作過程中形成氣溶膠導致樣品交叉污染。還可以用付世騫等[30]設計的無電加熱器替代水浴鍋，便于現場即時檢測。綜上所述，本研究為探索基于blaCARB-17基因的LAMP試劑盒產品提供可能。