玉米中伏馬毒素B1、B2間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附方法的建立

于瑤，李巖松，盧士英，楊勇，胡盼，任洪林，柳增善，周玉,2*

1(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(吉林大學(xué))，吉林 長(zhǎng)春，130062)2(長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州，434023)

伏馬毒素(fumonisins，F(xiàn)Bs)是GELDERBLON等于1988年從串珠鐮刀菌的培養(yǎng)液中首次分離出來(lái)[1],廣泛分布于世界各地，污染各種糧食作物，尤其是玉米及其加工產(chǎn)品。此外，在其他作物或農(nóng)產(chǎn)品中也檢測(cè)到FBs污染，例如水稻、面粉、谷物及其制品、干豆、堅(jiān)果等。FBs分為A、B、C、D四大類，目前已發(fā)現(xiàn)的有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FD1，共11種。其中毒性最強(qiáng)的為FB1，在FBs糧食污染中占60%以上[2]，其次為FB2，天然污染的玉米籽粒中被FB1和FB2污染的比例為3∶1[3]。

FBs具有多種毒性，主要包括神經(jīng)毒性、組織器官毒性、致癌性、免疫毒性、細(xì)胞毒性、生殖毒性等[4-6]。據(jù)2016年中國(guó)飼料和原料霉菌毒素檢測(cè)報(bào)告顯示[7]，最近幾年全球FBs污染趨勢(shì)明顯升高, 在食品與飼料安全中的危害引發(fā)人們的廣泛關(guān)注[8]。目前，我國(guó)對(duì)玉米中FBs殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為 4 mg/kg[9]，歐盟及美國(guó)為2 mg/kg[10]，瑞典為1 mg/kg[2]。現(xiàn)有的 FBs檢測(cè)方法有高效液相色譜-固相熒光法[11]、免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法[12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、免疫學(xué)檢測(cè)方法[14]等。這些檢測(cè)方法需要大型儀器設(shè)備及專業(yè)操作人員，不便于實(shí)際檢測(cè)中的樣品篩查。免疫學(xué)檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，尤其是間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA)在小分子物質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛，具有簡(jiǎn)單、靈敏、高效的優(yōu)點(diǎn)[15]，適合大量樣品的初篩。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FB1、FB2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、T-2毒素、黃曲霉素B1(aflatoxin B1，AFB1)，青島Pribolab生物工程有限公司；FB1單克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室自制[16]；吐溫-20，美國(guó)Amresco公司；辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗小鼠 IgG，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)，生工生物工程(上海)有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，北京梅科萬(wàn)德生物科技有限公司；酶標(biāo)板，廣州潔特生物過(guò)濾制品有限公司。

酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；電子天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；高速低溫冷凍離心機(jī)(Biofuge Primo R)，美國(guó)Thermo Fisher科技公司；酶標(biāo)板振蕩器(MTS2/4)、高速勻漿機(jī)(ULTRA-TURRAX T-10 basF)，德國(guó)IKA；-80 ℃超低溫冰箱，三洋電器；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-120)，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ic-ELISA條件優(yōu)化

抗原BSA-FB1梯度稀釋為2、1、0.5、0.25、1.25、0.062 5 mg/L。單抗體分別稀釋為0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/L。通過(guò)ic-ELISA方法確定抗原和單抗體的最佳使用質(zhì)量濃度。

根據(jù)上述優(yōu)化條件，在相同反應(yīng)條件下，分別進(jìn)行包被條件(4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、37 ℃ 4 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 1 h)，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)(1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000)和底物作用時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)3組ic-ELISA實(shí)驗(yàn)，比較不同條件的P/N (陽(yáng)性孔OD450nm值/空白孔OD450 nm值)，選擇最大值以確定檢抗原包被條件、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)、底物作用時(shí)間。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將8個(gè)質(zhì)量濃度的FB1溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0 μg/L)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5孔，按照ic-ELISA法測(cè)定獲得相應(yīng)的OD450 nm，以抑制率為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0，標(biāo)準(zhǔn)品0 ng/mL的吸光度值；A，標(biāo)準(zhǔn)品不同質(zhì)量濃度的吸光度值。

1.2.3 特異性驗(yàn)證

為驗(yàn)證建立的方法特異性，選FB1、FB2、DON、ZEA、T-2、AFB1六種真菌毒素做交叉反應(yīng)試驗(yàn)。交叉反應(yīng)率按公式(2)計(jì)算:

(2)

1.2.4 加標(biāo)回收

將磨細(xì)的玉米樣品1 g加至5 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇緩沖液中，超聲10 min后將固液混合物4 000×g離心5 min。取上清液用磷酸緩沖鹽溶液10倍稀釋用于ic-ELISA。設(shè)定FBs(按FB1與FB2總量計(jì)，F(xiàn)B1與FB2質(zhì)量比為3∶1)加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2、1、0.25 g/kg，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)做3個(gè)重復(fù)，按公式(3)計(jì)算回收率[17-18]。

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原包被和單抗體質(zhì)量濃度的確定

ic-ELISA檢測(cè)方法結(jié)果見表1。OD值是1左右相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為抗原、抗體最佳使用質(zhì)量濃度[15]，選擇抗原包被質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，抗體質(zhì)量濃度為0.2 mg/L。

表1 包被抗原、抗體最佳用量的確定Table 1 The optimal amount of coating antigen and antibody

2.2 抗原最佳包被條件的確定

包被條件結(jié)果見圖1。在相同溫度下，包被時(shí)間過(guò)短會(huì)因抗原包被量少導(dǎo)致P/N值降低；包被時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則N值變大從而導(dǎo)致P/N值降低。結(jié)果表明，4 ℃ 12 h 時(shí)P/N值最大，因此抗原最佳包被條件為4 ℃包被12 h。

圖1 最佳包被條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of coating condition

2.3 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的確定

在ic-ELISA檢測(cè)中，單克隆抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合至關(guān)重要，稀釋倍數(shù)大，可節(jié)約二抗，但稀釋倍數(shù)過(guò)大會(huì)導(dǎo)致底物顯色不完全。將0.4 mg/L HRP-山羊抗小鼠IgG分別稀釋2 000、3 000、4 000、5 000、6 000倍，做ic-ELISA。由圖2可知，3 000倍稀釋時(shí)P/N值較高，故選擇3 000倍作為酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)。

圖2 酶標(biāo)二抗工作質(zhì)量濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of IgG-HRP working concentrations

2.4 底物作用時(shí)間的確定

對(duì)底物作用時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3。隨著底物作用時(shí)間增加，P/N值逐漸增加后趨于平穩(wěn)，但底物作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，P/N值下降。綜合反應(yīng)時(shí)間和P/N值，選擇15 min作為合適的底物作用時(shí)間。

圖3 底物最佳作用時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of reaction time of substrate

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按1.2.2中的方法繪制抑制曲線，結(jié)果見圖4。線性回歸方程為：y=37.869x-99.289，R2=0.973 6。線性范圍(抑制率20%～80%)為 1.41～54.2 mg/L，最低檢測(cè)限(抑制率10%)為 24.5 μg/kg。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.4 Establishment of standard curve

2.6 特異性

取真菌毒素FB1、FB2、DON、ZEA、T-2、AFB1，按照已經(jīng)優(yōu)化好的ic-ELISA條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。FB1與FB2交叉反應(yīng)率為129.88%，與DON、ZEA、T-2、AFB1的交叉反應(yīng)率均小于10%。

表2 交叉反應(yīng)率的測(cè)定Table 2 The determination of the cross-reactivity

2.7 加標(biāo)回收

為驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確度，對(duì)玉米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收。在加標(biāo)回收之前，所有的玉米樣品都進(jìn)行ic-ELISA檢測(cè)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FBs。回收率測(cè)定結(jié)果(表3)表明，本研究所建立的方法回收率為89.36%～108.54%，且變異系數(shù)低于5%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好。這些結(jié)果表明，本研究所建立的ic-ELISA檢測(cè)方法可以應(yīng)用于玉米樣品中FB1、FB2的檢測(cè)。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 3 The recovery of ic-ELISA

3 討論

本方法最低檢測(cè)限為 24.5 μg/kg，與我國(guó)現(xiàn)行有效的食品中FBs測(cè)定方法，包括免疫親和柱凈化-柱后衍生高效液相色譜法(17 μg/kg)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(7 μg/kg)，免疫親和層析凈化-柱前衍生高效液相色譜法(17 μg/kg)[19]，出口花生、谷類及其制品中FBs測(cè)定方法液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法(20 μg/kg)[20]接近，并且不需要高效液相色譜儀等大型儀器。優(yōu)于國(guó)家規(guī)定的糧油中FBs測(cè)定方法超高效液相色譜法(50 μg/kg)[21]檢測(cè)限。滿足國(guó)家規(guī)定的玉米中FBs最大殘留限量要求[9]。

本方法對(duì)玉米的加標(biāo)回收率為89.36%～108.54%，優(yōu)于報(bào)道的其他免疫學(xué)方法[22-23]。回收率的大小可以評(píng)價(jià)定量分析的準(zhǔn)確度，通常情況下，回收率越高，定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確率就越高[24]。影響加標(biāo)回收率的因素很多，包括測(cè)定方法本身的缺陷、加標(biāo)量的水平及準(zhǔn)確性、加標(biāo)體積、操作人員水平、樣本底值和樣品的均勻性等[25]。饒正華等[23]利用免疫親和層析-熒光度法對(duì)飼料中的FB2進(jìn)行測(cè)定，平均回收率為89.22%，蛋白質(zhì)污染問(wèn)題使其準(zhǔn)確度明顯低于ic-ELISA方法。管笛等[22]利用磁微粒酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定玉米中的FB1，回收率在 76.4%～92.0%，該方法雖提高了檢測(cè)靈敏度，但準(zhǔn)確度不及ic-ELISA。

4 結(jié)論

本研究建立了對(duì)于FB1、FB2的ic-ELISA檢測(cè)方法，并對(duì)條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，線性檢測(cè)范圍為 1.41～54.2 μg/L，最低檢測(cè)限為24.5 μg/kg，實(shí)測(cè)玉米樣品加標(biāo)回收率為89.36%～108.54%。交叉反應(yīng)結(jié)果顯示，與伏馬毒素FB1和FB2交叉反應(yīng)率分別為100%和129.88%，與其他真菌毒素交叉反應(yīng)均小于10%。本檢測(cè)方法可特異性地檢出FB1和FB2。