苦竹筍總黃酮大孔樹脂純化工藝及其體外抗炎活性研究

晏俊玲，樊揚(yáng)，秦川，歐雪,陳姝娟，敖曉琳

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

苦竹筍為禾本科苦竹(Pleioblastusamarus)的嫩芽，廣泛分布于我國南方地區(qū)[1]。在我國不僅是一種傳統(tǒng)的綠色食品原料，還被用于民間醫(yī)學(xué)，治療痢疾、腹瀉、糖尿病、炎癥和傳染病等[2]。近年來，竹筍因其較高的藥用價(jià)值和開發(fā)利用前景而受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，苦竹筍中含有黃酮類、蛋白質(zhì)、膳食纖維、生物堿和木質(zhì)素及微量元素等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。苦竹葉和苦竹枝黃酮的純化工藝和生物活性已有報(bào)道，但目前對(duì)苦竹筍黃酮的純化工藝和生物活性尚未闡明。因此，本試驗(yàn)以苦竹筍總黃酮含量為指標(biāo)，通過考察大孔吸附樹脂對(duì)苦竹筍黃酮的吸附性能，篩選出最佳純化工藝條件。此外，在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的RAW264.7細(xì)胞中，對(duì)純化的苦竹筍總黃酮的抗炎特性進(jìn)行了評(píng)估，以期為后續(xù)開發(fā)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

苦竹筍采自四川省雅安市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海瑞永生物科技有限公司；NaNO2、無水乙醇、NaOH等化學(xué)試劑均為分析純，大孔吸附樹脂ADS-17、HPD500、S-8、HPD400、HPD100、AB-8、X-5、NKA-9、D101，華溢新材料, 其主要性能參數(shù)見表1所示。

表1 大孔吸附樹脂的型號(hào)及物理性能Table 1 Models and physical properties of macroporous adsorption resin

1.2 儀器設(shè)備

Varioskan LUX酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；FA2004B電子天平，上海精天電子儀器有限公司；FW135高速冷凍干燥機(jī)，永康市小寶電器有限公司；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-18S真空冷凍干燥機(jī)，上海力辰邦西儀器科技有限公司；S28L超聲波清洗器，東莞市墨潔超聲波設(shè)備有限公司；7D-4Z臺(tái)式高速離心機(jī)，蜀科儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 苦竹筍總黃酮提取液的制備

苦竹筍經(jīng)凍干粉碎、脫脂處理后，在料液比1∶27(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)88%、超聲功率200 W、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間25 min的條件下，提取2次，過濾后合并2次濾液，減壓濃縮無醇味后置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總黃酮含量測定

參照吳昊等[5]的方法并稍作修改。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定苦竹筍總黃酮含量。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg于20 mL的容量瓶中，并用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解，即得1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL 容量瓶中，分別加入300 μL的50 g/L NaNO2溶液，揺勻靜置5 min，再加入300 μL的100 g/L Al(NO3)3溶液，揺勻靜置5 min，最后加入4.0 mL 40 g/L NaOH溶液，體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容，揺勻靜置15 min,在510 nm波長處測量吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=4.845 2x-0.003 3，R2=0.999 8，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮的含量。

2.3 靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

2.3.1 大孔吸附樹脂選型

2.3.1.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

大孔吸附樹脂預(yù)處理參照馮靖等[6]的方法并略作修改。9種大孔吸附樹脂用去離子水沖洗，除去白色漂浮物，濾紙吸走樹脂水分，再用無水乙醇浸泡樹脂24 h，去離子水沖洗至無醇味，沖洗液無白色渾濁，40 g/L HCl溶液浸泡5 h，去離子水反復(fù)沖洗至中性，40 g/L NaOH溶液浸泡5 h，去離子水清洗樹脂至中性，濾紙吸去樹脂表面水分，備用。

2.3.1.2 樹脂吸附量、吸附率及解吸率的測定

準(zhǔn)確稱量已處理好的9種大孔吸附樹脂(ADS-17, HPD500, S-8, HPD400, HPD100, AB-8, X-5, NKA-9, D101)各2 g分別放入錐形瓶中，向其中各加入粗提取液20 mL(總黃酮濃度1.55 mg/mL)，封口，在25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器上避光振蕩12 h，待充分吸附后，過濾，取上清液，按照2.2的方法測定吸光度值，按照公式(1)(2)計(jì)算樹脂吸附量和吸附率。將吸附后的樹脂分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù) 50%乙醇，封口后，置于20 ℃、120 r/min的氣浴恒溫?fù)u床上連續(xù)振蕩12 h，使其完全解吸附，過濾后測定吸光度值。按照公式(3)計(jì)算樹脂解吸率[7]。

(1)

(2)

(3)

式中：q，飽和吸附量，mg/g；C1，苦竹筍粗提液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2，吸附飽和后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1，吸附液總體積，mL；m，樹脂干重，g；C3，解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V2，解吸液總體積，mL。

2.3.1.3 大孔吸附樹脂動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2.0 g AB-8樹脂置于錐形瓶中，再加入20 mL苦竹筍總黃酮粗提液(1.55 mg/mL)后將錐形瓶放于氣浴恒溫?fù)u床內(nèi)，在25 ℃、120 r/min的條件下，充分振蕩12 h，每隔一定時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60、90、120、270、360、480、600、720 min)取1 mL上清液，測定總黃酮質(zhì)量濃度[8]。為了更好地了解可能的吸附機(jī)理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用粒子內(nèi)擴(kuò)散模型、準(zhǔn)一級(jí)和二級(jí)模型進(jìn)行分析，計(jì)算方程分別見公式(4)(5)和(6)[8]。

粒子內(nèi)擴(kuò)散模型線性關(guān)系為：qt=kit0.5+C

(4)

準(zhǔn)一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)模型：ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(5)

(6)

式中：ki，擴(kuò)散速率常數(shù)，mg/(g·min0.5)；k1，一級(jí)吸附速率常數(shù)，min-1；k2，二級(jí)吸附速率常數(shù)，g/(mg·min)；C，常數(shù)；qe，平衡時(shí)吸附量；qt，t時(shí)刻的吸附量，mg/g。

2.3.1.4 吸附等溫線和熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)[9]

制備不同質(zhì)量濃度(0.31、0.62、0.93、1.24、1.55、1.86 mg/mL)的總黃酮樣品，稱取2.0 g樹脂置于錐形瓶中，再加入20 mL樣品溶液，分成3組，每組含有6種不同濃度的樣品，分別置于25、35和45 ℃，120 r/min的氣浴恒溫?fù)u床上連續(xù)振蕩12 h，測定總黃酮含量，為研究吸附特性，采用Freundlich和Langmuir模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，F(xiàn)reundlich和Langmuir模型的吸附等溫方程分別見公式(7)(8)：

(7)

(8)

式中:qm，最大吸附容量，mg/g,Ce，吸附平衡后的質(zhì)量濃度，mg/mL；KL，Langmuir模型的平衡常數(shù)，mL/mg；KF，F(xiàn)reundlich常數(shù)，(mg/g或mL/mg)1/n；1/n，n為表現(xiàn)常數(shù)，表示吸附優(yōu)惠性。

吸附熱力學(xué)分析能提供更多的理論信息，進(jìn)一步揭示能量變化和吸附機(jī)理，因此分析等量吸附焓變(ΔH)、吸附自由能變(ΔG)、吸附熵變(ΔS)等研究AB-8樹脂的熱力學(xué)性質(zhì)[10]，具體計(jì)算見公式(9)(10)和(11)：

(9)

ΔG/(kJ·mol-1)=-lnKRT

(10)

(11)

式中：KL，Langmuir模型的平衡常數(shù)，mL/mg；M，蘆丁的摩爾質(zhì)量，610.51 g/mol；R，氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)；T，吸附溫度,K。

2.3.1.5 上樣液pH值對(duì)大孔吸附樹脂吸附的影響[9]

稱取AB-8樹脂2 g于具塞錐形瓶中，分別加入pH值為2、3、4、5、6、7、8、9、10的粗提液20 mL(總黃酮質(zhì)量濃度1.55 mg/mL)，然后將其置于25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器中，振蕩12 h，充分吸附后測定苦竹筍總黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算其吸附率。

2.3.1.6 乙醇濃度對(duì)大孔吸附樹脂解吸的影響

取充分吸附飽和的AB-8樹脂2 g于具塞錐形瓶中，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進(jìn)行解吸，置于25 ℃、120 r/min的氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h，充分解吸后測定苦竹筍總黃酮質(zhì)量濃度，并計(jì)算其解吸率。

2.4 動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)

為探索最優(yōu)的富集工藝，利用層析柱(1.6 cm×50 cm)填充AB-8樹脂，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，床層體積為25 mL。采用不同流速(1、2、3、4 BV/h)(1 BV=25 mL)負(fù)載粗液(總黃酮質(zhì)量濃度1.55 mg/mL)進(jìn)行吸附工藝研究，根據(jù)樹脂柱對(duì)總黃酮吸附能力選擇最佳流速及流量。先用去離子水沖洗樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)脫附處理，然后以不同流速(1、2、3、4 BV/h)用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液解吸處理，來優(yōu)化解吸液的流速和用量。

2.5 工藝驗(yàn)證

按照上述試驗(yàn)所確定的純化苦竹筍黃酮的最佳工藝條件，進(jìn)行驗(yàn)證，收集洗脫液，濃縮后凍干成粉末。按照公式(12)計(jì)算純度：

(12)

2.6 抗炎活性研究

2.6.1 總黃酮純化液的制備

稱取苦竹筍粉末50 g，按照2.1的方法制備苦竹筍總黃酮粗提液，再根據(jù)最優(yōu)純化工藝進(jìn)行處理，減壓濃縮后無醇味置于4 ℃中備用。

2.6.2 抗炎活性測定

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2及適宜濕度條件下在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再參照段慶等[11]的方法并稍作修改，采用Griess法檢測苦竹筍總黃酮純化物對(duì)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)NO活性的抑制作用，將1×104個(gè)/孔R(shí)AW264.7細(xì)胞接種于細(xì)胞96孔板中，每孔體積為100 μL，接種孔周圍加入新鮮培養(yǎng)基用來排除邊緣效應(yīng)，待細(xì)胞貼壁后棄去多余培養(yǎng)基，并進(jìn)行藥物處理。各孔藥物處理組分為：陰性對(duì)照組(不含有LPS和樣品)；模型組(LPS組，含有0.5 μg/mL LPS)；實(shí)驗(yàn)組(總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.14、0.32、0.5、0.68、0.86、1.04 mg/mL)。分別預(yù)處理2 h后，除陰性對(duì)照組外各組均加入0.5 μg/mL LPS 0.5 μL處理18 h，再吸取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，依次加入恢復(fù)室溫后的Griess ResgentⅠ50 μL和Griess ResgentⅡ50 μL，充分反應(yīng)后于550 nm波長處檢測吸光度。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 九種大孔吸附樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的靜態(tài)吸附與解吸性能

9種大孔樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮吸附能力和解吸能力對(duì)比研究結(jié)果見圖1。大孔吸附樹脂對(duì)成分的分離特性受很多因素的影響，如樹脂的比表面積、極性和孔徑大小、溶液性質(zhì)等[13]。根據(jù)圖1可知，因樹脂的物理化學(xué)性質(zhì)不同導(dǎo)致在相同條件下出現(xiàn)不同的結(jié)果，9種大孔樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的“吸附-解吸”能力都有所不同，其中HPD100、HPD400和AB-8型樹脂對(duì)黃酮類化合物的吸附能力及解吸能力均優(yōu)于其他樹脂，AB-8的吸附解吸性能最佳，其吸附率79.65%，解吸率68.73%。AB-8是弱極性樹脂，可推測苦竹筍中含有弱極性黃酮，3種樹脂的比表面積相差不大，而平均孔徑AB-8明顯大于HPD400和HPD100，說明在本研究中，樹脂的極性性質(zhì)和孔徑對(duì)吸附解吸過程影響較大。綜合考慮幾種大孔樹脂的吸附量、吸附率和解吸率,選擇AB-8進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)研究。

圖1 九種樹脂對(duì)總黃酮的吸附/解吸率及吸附量Fig.1 Adsorption/desorption ratio and adsorption capacity of total flavonoids of different resins

3.2 大孔吸附樹脂動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

吸附動(dòng)力學(xué)研究對(duì)設(shè)備選型和工藝設(shè)計(jì)具有重要意義。本文研究了在25 ℃條件下，苦竹筍總黃酮在AB-8樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，如圖2-a顯示，AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附能力在0～120 min快速上升，之后緩慢上升，400 min達(dá)到吸附平衡，其平衡時(shí)吸附量達(dá)到12.77 mg/g。可能是因?yàn)閯傞_始吸附時(shí)(0～100 min)，樹脂表面可提供充足的吸附位點(diǎn)，吸附初期樣品溶液中的總黃酮質(zhì)量濃度較高，可提供較大的推動(dòng)力來克服阻力，吸收速率較快。隨著吸附時(shí)間延長到達(dá)吸附中期(100～300 min)，樹脂的吸附位點(diǎn)趨于飽和，溶質(zhì)從樹脂表面進(jìn)入其內(nèi)部時(shí)受到一定阻力，吸附速率隨之減慢。最后吸附處于平衡階段(400～720 min)[14]。

圖2b-d顯示的是在25 ℃條件下擬合的3種動(dòng)力學(xué)模型，其吸附動(dòng)力學(xué)方程及相關(guān)參數(shù)如表2所示。在粒子內(nèi)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型中，當(dāng)擬合的qt對(duì)t0.5的曲線是一條過原點(diǎn)的直線，說明吸附速率是由粒子內(nèi)擴(kuò)散來控制的，如果是一條不通過原點(diǎn)的直線或者是混合曲線時(shí)，說明吸附速率不僅受粒子內(nèi)部擴(kuò)散控制，同時(shí)還受液膜層擴(kuò)散控制[8]。從圖2-b可知，擬合曲線是混合曲線，呈現(xiàn)出2個(gè)階段，可見吸附速率是由液膜層擴(kuò)散和粒子內(nèi)擴(kuò)散雙重控制的。由表2中AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)方程及參數(shù)可知，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果的線性關(guān)系較好，其相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，粒子內(nèi)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)相關(guān)系數(shù)最小，兩階段分別為0.996 9和0.977 7。因此，AB-8大孔樹脂對(duì)苦筍總黃酮的吸附作用更符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附模型，且由準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合得出的qe與實(shí)驗(yàn)測定的qe較為接近。

圖2 總黃酮在AB-8樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(a)、粒子內(nèi)擴(kuò)散(b)、準(zhǔn)二級(jí)(c)和準(zhǔn)一級(jí)(d)吸附模型擬合曲線Fig.2 Adsorption kinetics curves (a), intra-particle diffusion (b), quasi-secondary (c) and quasi-primary (d) of total flavonoids on AB-8 resin

表2 AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)方程及參數(shù)Table 2 Adsorption kinetics equations and parameters of total flavonoids on AB-8 resin

3.3 吸附等溫線模型

通常用線性擬合來描述不同溫度下不同濃度的樣品(吸附質(zhì))和吸附劑的吸附平衡關(guān)系[15]。3個(gè)不同溫度條件下AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附等溫線及其線性相關(guān)結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出，隨著樣品初始總黃酮濃度增加，吸附能力增強(qiáng)。黃酮濃度較低時(shí)，吸附能力迅速提高，吸附后平衡濃度(Ce)達(dá)0.5 mg/mL左右時(shí)達(dá)到飽和，其吸附量趨于平衡，此時(shí)上樣液總黃酮濃度為1.55 mg/mL。可能是因?yàn)樯蠘右簼舛仍黾樱c樹脂單位表面積接觸的黃酮較多，吸附性能較好[16]，但上樣液濃度過高，雜質(zhì)也會(huì)增加，樹脂容易堵塞，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)吸附過載的情況，使得苦竹筍中的總黃酮沒有被吸附完全，也易發(fā)生沉淀和絮凝等現(xiàn)象，因此最佳吸附濃度為1.55 mg/mL。并且溫度越低，平衡時(shí)吸附量越高，25 ℃時(shí)平衡吸附量約12.00 mg/g左右，由此可知適當(dāng)?shù)慕禍赜兄贏B-8樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的吸附。

圖3 不同溫度條件下AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附等溫線及其線性相關(guān)Fig.3 Adsorption isotherm of AB-8 resin on total flavonoids at different temperatures and its linear correlation

Langmuir模型描述的是單分子層吸附過程，所有吸附位點(diǎn)均勻且具有相同的能量，被吸附分子之間沒有相互作用，而單分子層和多分子層的吸附都可以用Freundlich模型模擬，F(xiàn)reundlich模型吸附位點(diǎn)位于非均相表面上且具有不同能量，吸附分子間可能存在相互干擾[17]。

表3 不同溫度條件下AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附影響 單位：mg/mL

圖4建立了分別在25、35、45 ℃條件下AB-8樹脂對(duì)總黃酮的Langmuir 和Freundlich 模型及其線性相關(guān)，表4總結(jié)了3種溫度下的吸附等溫線回歸方程及其相關(guān)參數(shù)，從表3中可看出，Langmuir模型模擬的回歸方程相關(guān)系數(shù)總體高于Freundlich模型，說明Langmuir吸附等溫線更能準(zhǔn)確反映苦竹筍黃酮在AB-8樹脂上的吸附過程。由Langmuir等溫線模型可知，當(dāng)溫度從25 ℃提高到45 ℃時(shí)，qm從14.13降至13.75 mg/g，表明苦竹筍總黃酮對(duì)AB-8型樹脂的吸附是放熱的。而在Freundlich等溫線模型中，25 ℃時(shí)，KF值最高，吸附溫度升高而KF值反而降低，說明吸附也是放熱的，這與等溫吸附曲線(圖3)所呈現(xiàn)的結(jié)果相同。因?yàn)闇囟壬呖赡軙?huì)加速溶液中分子的熱運(yùn)動(dòng)，從而降低黃酮與樹脂活性部位之間的接觸力，從而降低吸附量[18]。同時(shí)1/n值在0.1～0.5，說明AB-8樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的吸附是有利的。

3.4 熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)

以1/T為橫坐標(biāo)，lnK為縱坐標(biāo)對(duì)Van’t Hoff方程進(jìn)行線性擬合，由直線的斜率和截距可分別算出ΔH和ΔS，相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)表5。

圖4 不同溫度條件下AB-8樹脂對(duì)總黃酮的Langmuir (a) 和Freundlich (b)模型及其線性相關(guān)Fig.4 Langmuir (a) and Freundlich (b) models of AB-8 resin on total flavonoids at different temperatures and their linear correlation

表4 AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附等溫線方程及其相關(guān)參數(shù)Table 4 Adsorption isotherm equations and parameters of total flavonoids on AB-8 resin

表5 不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)Table 5 Thermodynamic parameters at different temperatures

25、35、45 ℃時(shí)吸附熱力學(xué)參數(shù)如表4所示。ΔG<0說明吸附是自發(fā)的，ΔH<0表明該吸附是放熱的，這與等溫吸附模型結(jié)果一致，此外，ΔH<40 kJ/mol且0 kJ/mol<|ΔG|<20 kJ/mol,表明AB-8樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的吸附是物理吸附過程，這符合常規(guī)大孔吸附樹脂的吸附規(guī)定[12]。同時(shí)ΔS>0，這可能是由于吸附過程中，溶質(zhì)吸附同時(shí)也伴隨著溶劑脫附，即溶劑置換過程，隨著樹脂表面的吸附位點(diǎn)不斷被黃酮分子覆蓋，大量水分子脫附，吸附體系中溶質(zhì)的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于溶劑(水)的體積，同時(shí)水的摩爾體積小于吸附質(zhì)的摩爾體積，更有利于在溶液中作自由運(yùn)動(dòng)，而水分子脫附產(chǎn)生的熵變也大于總黃酮吸附所產(chǎn)生的熵變，所以導(dǎo)致整個(gè)吸附體系混亂度增加。這于徐祖?zhèn)サ萚12]研究結(jié)果相似。

3.5 pH對(duì)AB-8樹脂吸附性能的影響

上樣液pH值對(duì)樹脂的吸附能力有重要影響。pH值可以通過影響樣品分子的電離程度來影響溶質(zhì)與吸附劑之間的親和力[19]。如圖5所示，當(dāng)樣品溶液pH值從2增加到7時(shí)，樹脂吸附率呈上升趨勢(shì)，在pH值為7時(shí)達(dá)到最大吸附率(75.17%)，而后吸附率不斷下降。可見，過酸過堿的環(huán)境都會(huì)影響樹脂對(duì)苦竹筍總黃酮的吸附，也有研究表明黃酮類化合物在過酸過堿的環(huán)境中的穩(wěn)定性較差[6]，這可能由于pH較高，黃酮類化合物中的酚羥基更易分離H+，氫鍵相互作用減少，從而導(dǎo)致出現(xiàn)較低的吸附能力。因此最佳上樣液pH值為7。

圖5 上樣液pH值對(duì)吸附率的影響Fig.5 Effect of pH value on adsorption rate

3.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)AB-8樹脂解吸性能的影響

乙醇是一種易于從溶液中去除、可循環(huán)利用、價(jià)格低廉的有機(jī)溶劑，因其安全性較好在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用廣泛[20]。因此，在本研究中，選取不同體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇作為洗脫液，對(duì)苦竹筍總黃酮進(jìn)行靜態(tài)解吸，結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響Fig.6 Effect of concentration of ethanol concentration on adsorption rate注:與乙醇體積分?jǐn)?shù)50%相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

結(jié)果表明，其解吸率分別為15.83%、47.89%、77.79%、39.15%、32.96%。由此可見，隨著洗脫劑濃度的增加，解吸率也在增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，解吸率最大，而后解吸率反而降低。曾有相似研究也證實(shí)，黃酮類化合物不易溶解在較低濃度的乙醇中，而一些醇溶性雜質(zhì)可能溶解在高濃度的乙醇中，導(dǎo)致解吸性能在一定程度上下降[21-22]。

并且樹脂分子之間的吸附力與溶解度之間的相互作用對(duì)樹脂中黃酮類化合物的解吸起著重要作用，當(dāng)分子間作用力達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，黃酮類化合物會(huì)從樹脂中解吸到溶劑中。黃酮類化合物與樹脂之間也存在范德華力，當(dāng)兩者極性相近時(shí)，范德華力最大，AB-8為弱極性樹脂，這也說明苦竹筍總黃酮樣液中的黃酮類化合物極性較弱。因此50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇為苦竹筍總黃酮最佳洗脫劑。

3.7 動(dòng)態(tài)吸附解吸

上樣液體積和流速與飽和吸附量有很大的關(guān)系，因此通常建立不同上樣液流速下的動(dòng)態(tài)吸附曲線來優(yōu)化上樣液的流速和體積。上樣液流速影響黃酮樣液向樹脂內(nèi)表面擴(kuò)散，決定吸附效果，流速過大，黃酮樣液未完全被樹脂接觸，提早泄露，吸附性能降低；而流速過小，所需時(shí)間延長，生產(chǎn)效率低[23]。由圖7-a可知，流速越低，因適當(dāng)延長了吸附時(shí)間，越晚達(dá)到泄露臨界點(diǎn)。這可能是由于適當(dāng)延長吸附時(shí)間對(duì)粒子內(nèi)擴(kuò)散過程及液膜層擴(kuò)散有良好的影響，從而有助于提高吸附能力。一般情況下，流出液的目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度的1/10時(shí)，認(rèn)為達(dá)到了目標(biāo)物質(zhì)的泄露點(diǎn)，流速為1、2、3、4 BV/h時(shí)，泄露體積分別約為4.2、3.2、2.8、2.4 BV，因此綜合考慮1 BV/h為最佳上樣流速，進(jìn)樣體積為4.2 BV(105 mL)。由圖7-b可知，洗脫流速為4 BV/h時(shí)，解吸性能較好。洗脫速度為1、2、3、4 BV/h時(shí)，洗脫量分別約為4.5、5.8、6.5、8 BV，回收率達(dá)到50.96%、58%、64.52%、75.58%。因此選取4 BV/h為最佳流速，洗脫體積為8 BV(200 mL)。

圖7 AB-8樹脂柱在不同流速下總黃酮的動(dòng)態(tài)吸附曲線(a)和動(dòng)態(tài)解吸曲線(b)Fig.7 Dynamic breakthrough curves (a) and dynamic desorption curves (b) of total flavonoids on AB-8 resin column at different flow rates.

3.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述試驗(yàn)，確定了最適宜純化苦竹筍總黃酮的樹脂以及純化工藝條件，并且最佳工藝條件下，上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為1.55 mg/mL，樣液pH值為7，以1 BV/h的流速上樣4.2 BV(105 mL)，充分吸附后以去離子水沖至無色，再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇以4 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，洗脫體積為8 BV(200 mL)。結(jié)果表明，經(jīng)AB-8樹脂柱層析進(jìn)一步富集后，總黃酮回收率可達(dá)到(75.58±0.47)%，純度由原來的(2.46±0.59)%提高至(15.72±0.48)%，提高了約7倍。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定該條件有效可行，適宜于苦竹筍黃酮的純化。

3.9 抗炎活性

NO作為一種重要的炎性介質(zhì)，其濃度是評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[24]。粗提液與純化液樣品在不同總黃酮濃度(0.14～1.04 mg/mL)下的NO濃度對(duì)比結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，LPS能極顯著地誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的增加，NO濃度由4.84 μmol/L上升到38.47 μmol/L，增加了約8倍，與LPS組相比，不同質(zhì)量濃度的樣品液處理后,細(xì)胞NO生成量均表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，各樣品對(duì)NO濃度的抑制隨濃度的增加而增強(qiáng)，同等黃酮濃度下純化液的NO濃度普遍低于粗提液樣品，可見NO抑制率純化液樣品強(qiáng)于粗提液樣品，純化液樣品總黃酮濃度達(dá)到1.04 mg/mL抑制率可達(dá)到97.80%，最終NO濃度為5.60 μmol/L，而同一濃度下的粗提液樣品中NO濃度為13.81 μmol/L，抑制率僅為73.22%，說明苦竹筍總黃酮純化液可更好地抑制LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，本研究的苦竹筍純化方法是有效的。

圖8 苦竹筍總黃酮純化液對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞NO生成量的影響Fig.8 Effect of total flavone purification solution on NO production in LPS-induced mouse macrophages注:與LPS組比較:*表示P<0.05、**表示P<0.01

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了苦竹筍總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝，并對(duì)其體外抗炎活性進(jìn)行研究。在進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)之前，先對(duì)樹脂的篩選、吸附動(dòng)力學(xué)、吸附等溫線和熱力學(xué)進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明AB-8型樹脂為最佳大孔樹脂，對(duì)苦竹筍總黃酮吸附率為79.65%、解吸率為68.73%，準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Langmuir等溫線模型對(duì)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行了最佳描述，吸附過程放熱，降溫有利于吸附。確定純化最優(yōu)工藝為：上樣液濃度1.55 mg/mL，上樣液pH值為7，洗脫劑濃度50%(體積分?jǐn)?shù))，上樣量4.2 BV(105 mL)、上樣流速1 BV/h、洗脫劑用量8 BV(200 mL)、洗脫流速4 BV/h，經(jīng)AB-8樹脂柱層析進(jìn)一步富集后，總黃酮回收率可達(dá)到(75.58±0.47)%，純度由原來的(2.46±0.59)%提高至(15.72±0.48)%。此外，NO是一種常見的炎性介質(zhì), 過量的NO可導(dǎo)致一系列炎癥疾病的發(fā)生[25]。通過對(duì)粗提樣品和純化樣品的體外抗炎活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，同等黃酮濃度下純化液的NO濃度普遍低于粗提液樣品，純化樣品總黃酮濃度為1.04 mg/mL，抑制率可達(dá)到97.80%，最終NO濃度為5.60 μmol/L，而同一總黃酮濃度下的粗提樣品中NO濃度為13.81 μmol/L，抑制率僅為73.22%，由此說明，經(jīng)富集后的苦竹筍總黃酮表現(xiàn)出較好的抗炎活性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了苦竹筍總黃酮的富集方法，且開發(fā)的純化富集物是有效可行的，適用于苦竹筍總黃酮工業(yè)化生產(chǎn)，后續(xù)可進(jìn)一步通過各種色譜技術(shù)探索建立高純度總黃酮的富集純化方法。