艾葉精油微乳的表征及穩(wěn)定性研究

墻夢(mèng)捷,魯曉翔

(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津,300134)

艾葉為菊科蒿屬草本植物艾的干燥葉，含有多種營養(yǎng)成分包括蛋白質(zhì)、膳食纖維、必需氨基酸、多不飽和脂肪酸和多種活性物質(zhì)(精油、類黃酮、香豆素、有機(jī)酸和多糖)。艾葉具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)和殺蟲特性[1]。艾葉精油由艾草葉、莖通過水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法和石油醚萃取法提取，具有高折光率和旋光度，但具有溶解性差和氣味刺鼻等缺點(diǎn)，給其儲(chǔ)藏和使用帶來諸多不便，限制了其食品體系中的應(yīng)用[2]。

微乳是將油相和水相在表面活性劑和助表面活性劑復(fù)配的作用下，自發(fā)形成粒徑為 10～100 nm的穩(wěn)定均一、澄清透亮的熱力學(xué)穩(wěn)定體系[3]。微乳液能提高難溶藥物的溶解度，對(duì)藥物具有緩釋控釋作用，其粒徑小，能促進(jìn)藥物有效吸收，提高藥物生物利用度，對(duì)于易水解和揮發(fā)性強(qiáng)的藥物，有很好的保護(hù)作用[4]。

微乳具有穩(wěn)定性好、操作簡單和生物利用度高等特點(diǎn)[5]。本研究以艾葉精油為原料制備艾葉精油微乳，并對(duì)水包油(O/W)型艾葉精油微乳的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，為進(jìn)一步探索艾葉精油的應(yīng)用與開發(fā)提供技術(shù)和工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

主要試劑：艾葉精油(濃度99.99%)，江西省吉水縣康民本草用油提煉廠；無水乙醇，天津渤化化學(xué)有限公司；吐溫- 80，天津市化學(xué)試劑供銷公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)試劑，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。

主要儀器設(shè)備：7890n-5975型氣相色譜質(zhì)譜分析儀，安捷倫有限公司；MCR 301型流變儀，安東帕商貿(mào)有限公司；Mastersizer 3000型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；79-1型磁力攪拌器，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；ME104電子天平，梅特勒-托利儀器上海有限公司；DSA 100液滴分析儀，KRUSS德國克呂士公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微乳體系的表征

1.2.1.1 滴定法構(gòu)建艾葉精油微乳液擬三元相圖

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量吐溫-80和無水乙醇于燒杯中，磁力攪拌機(jī)攪拌45 min左右，然后將上述混合表面活性劑與油相以質(zhì)量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合置于50 mL燒杯中，使用磁力攪拌器400 r/min攪拌10 min，將混合物在室溫條件下靜置15 min，用移液管逐漸滴加去離子水，邊攪拌邊滴加。反復(fù)操作直至溶液由澄清變渾濁，且狀態(tài)不變。記錄臨界點(diǎn)去離子水的添加量(重復(fù)2次取平均值)，計(jì)算該組分在轉(zhuǎn)變點(diǎn)時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以混合表面活性劑、精油和去離子水作為三相用origin制作三相圖，并計(jì)算面積[6-7]。

1.2.1.2 流變法鑒定微乳構(gòu)型

使用流變儀，在25 ℃下，測(cè)定不同含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的微乳液(10 %～ 90 %)在不同剪切速率下(0～300 s-1)的黏度變化，使用4 cm平板，平板和樣品間距0.5 mm，取樣數(shù)50，間隔6 s[8]。

1.2.1.3 動(dòng)態(tài)光散射

采用激光粒度儀在室溫下測(cè)定粒徑尺寸、分布和zeta電位，測(cè)試光源為波長為659 nm，40 mW光泵半導(dǎo)體激光器，測(cè)試角度為90°，測(cè)試前將樣品用0.45 μm的微孔濾膜過濾除去樣品中的雜質(zhì)。重復(fù)測(cè)試3次，記錄測(cè)試的平均粒徑[9-10]。

1.2.1.4 不同類型微乳的表面張力

按照1.2.1.1的方法配制3種類型的微乳液[m(混合活性劑)∶m(艾葉精油)=7∶3]。采用液滴分析儀測(cè)定表面張力，測(cè)3次取平均值[11]。

1.2.1.5 透射電鏡觀察微乳狀態(tài)

使用透射電子顯微鏡研究O/W型微乳的形態(tài)。將銅網(wǎng)置于蠟板上，滴加2 μL微乳，自然風(fēng)干，把質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸(pH 7.4)滴在蠟板上，將晾干的銅網(wǎng)倒置于染液上，負(fù)染15 min，用蒸餾水沖洗，吸干，上電鏡觀察[12]。

1.2.2 艾葉精油微乳穩(wěn)定性及抗氧化性研究

1.2.2.1 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將微乳樣品置于4、25 ℃下儲(chǔ)藏，在第1、15、30、45天時(shí)分別測(cè)定微乳的粒徑。

1.2.2.2 離心穩(wěn)定性

配制含水量90%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))精油微乳，于2 000、4 000、6 000和8 000 r/min下離心30 min，觀察是否分層，以去離子水為空白對(duì)照。測(cè)定離心前后波長550 nm處的吸光度[13]。透光率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:T,透光率；A0,離心后的微乳吸光度；A1,離心前的微乳吸光度

1.2.2.3 自由基清除率的研究

(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Origin 8.5 對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 滴定法構(gòu)建艾葉精油微乳液擬三元相圖

表面活性劑和助表面活性劑的主要作用是降低互不相溶的液體之間的界面張力，在界面上形成吸附膜，促使微乳的形成[15]。擬三相圖是研究微乳體系相行為變化的最簡單和有效的方法，區(qū)域面積的大小反映物質(zhì)載油量的多少，在制備和應(yīng)用艾葉精油微乳液的過程中具有重要的指導(dǎo)作用[15]。由圖1可知，當(dāng)Km值(表面活性劑與助表面活性劑的比值)為2時(shí)，形成微乳區(qū)的面積比為53.87%。

圖1 艾葉精油微乳擬三相圖Fig.1 The quasi-three-phase of argyi leaf essential oil emulsion

圖2分別是油包水型(W/O)、雙連續(xù)相(B.C)和O/W 三種結(jié)構(gòu)的實(shí)物圖，分別對(duì)應(yīng)含水量20%、50%和90%。該條件下配制的微乳液顏色澄清透亮，不分層不絮凝，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時(shí)微乳液呈淡藍(lán)色乳光。

圖2 含水量為20%、50%和90%的艾葉精油微乳Fig.2 Microemulsion of argyi leaf essential oil with 20%, 50% and 90% water content

2.2 流變法鑒定微乳構(gòu)型

黏度是重要的物理參數(shù)，微乳液的宏觀黏度會(huì)受到微觀結(jié)構(gòu)的影響。微乳屬于牛頓型液體，采用流變儀測(cè)定不同含水量微乳液在不同剪切速率下的黏度變化[16]。艾葉精油/混合表面活性劑/水體系在Km=2時(shí)，不同含水量微乳黏度隨剪切速率的變化情況如圖3所示。

圖3 不同含水量艾葉精油微乳在不同剪切速率下的黏度Fig.3 Viscosity of argyi leaf essential oil microemulsion with different water content under different shear rates

微乳構(gòu)型可分為3個(gè)階段：第1階段，當(dāng)水分含量較少時(shí)，顆粒之間的相互作用很弱，黏度接近于油，此時(shí)微乳液是W/O型；第2階段，隨著水分含量的增加，微乳液構(gòu)型W/O向B.C轉(zhuǎn)變，此時(shí)顆粒間作用力增大，黏度也隨之上升至最大值；第3階段，水分含量進(jìn)一步增加，水作為連續(xù)相，黏度值急速下降，此時(shí)體系為O/W型結(jié)構(gòu)[17-18]。為了更加直觀方便的觀察不同含水量微乳黏度與剪切速率的關(guān)系，選擇剪切速率為153 s-1時(shí)微乳的平衡黏度來比較。當(dāng)水分含量<20%時(shí)微乳的黏度在0～20 mPa·s之間變化，此時(shí)微乳的構(gòu)型為W/O。水分含量從30%增加到50%時(shí)，微乳黏度增長幅度較大，這是因?yàn)榇穗A段雙連續(xù)相構(gòu)成，界面面積逐漸增加，界面之間相互作用也更加緊密，導(dǎo)致微乳體系黏度不斷增加，含水量為50% 時(shí)達(dá)到最大黏度值(約為67 mPa·s)，此時(shí)體系為B.C結(jié)構(gòu)向O/W型微乳的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。含水量大于50% 時(shí)，體系黏度迅速降低，其原因是過量的水稀釋了微乳體系，降低了膠束之間的相互作用及相互碰撞的概率[19](圖4)。

圖4 不同含水量艾葉精油微乳在153 s-1下的黏度Fig.4 Viscosity of argyi leaf essential oil microemulsion with different water content at 153 s-1

2.3 動(dòng)態(tài)光散射

采用激光粒度儀在室溫下測(cè)定艾葉精油微乳的平均粒徑、zeta電位和多分散指數(shù)(polydispersity index,PDI)。由圖5、圖6可知,zeta電位(-2.18±0.77) mV、粒徑(39.91±1.55)nm、PDI(0.28±0.068)，艾葉精油制備的微乳的粒徑較小，電性呈中性，體系穩(wěn)定。

圖5 O/W型艾葉精油微乳電位分布圖Fig.5 Potential distribution of microemulsion of O/W argyi leaf essential oil

2.4 表面張力

采用液滴分析儀中懸滴法，當(dāng)液滴在滴管口形成液滴時(shí)，此時(shí)液滴的質(zhì)量和表面張力平衡。由表1可知，表面張力與溫度呈負(fù)相關(guān)，即溫度越高，表面張力越小。含有表面活性劑的微乳液在不同溫度下表面張力的變化略大于水和乙醇，這可能是和物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)。同等溫度下微乳液的表面張力低于水的表面張力，這是因?yàn)楸砻婊钚詣┓肿优c空氣分子的作用力高于水分子與空氣分子之間的作用力，從而導(dǎo)致水表面張力降低[20]。隨著溶液中表面活性劑濃度的增加，排列的表面活性劑分子越多，水分子越少，溶液的表面張力降低。在20、30 ℃條件下，B.C型微乳的表面張力略大于O/W和W/O型微乳液，其原因是因?yàn)锽.C相的黏度相對(duì)最大，表面活性劑遷移速度較慢，表面張力平衡時(shí)間短，容易造成水分子和表面活性劑分子不平衡[21]。

圖6 O/W型艾葉精油微乳粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution of O/W type argyi leaf essential oil microemulsion

表1 不同溫度下3種類型艾葉精油微乳表面張力的比較Table 1 Comparison of surface tension of different argyi leaf essential oil microemulsions at different temperatures

2.5 艾葉精油微乳透射電鏡圖

艾葉精油/混合表面活性劑/水體系在Km=2，稀釋比為7∶3時(shí)，水分含量為90%的艾葉精油微乳在銅網(wǎng)上自然風(fēng)干后的透射電鏡圖如圖7所示，微乳顆粒表面呈凹凸的球狀或類球狀分布，該微乳體系粒子分散均勻、不聚集[22]。

a-×6 000; b-×10 000;c-×20 000圖7 O/W型艾葉精油微乳的透射電鏡圖Fig.7 Transmission electron microscopy of O/W type argyi leaf essential oil microemulsion

2.6 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

從圖8可知,微乳粒徑隨著時(shí)間的延長而增加，在25、4 ℃條件下儲(chǔ)藏45 d粒徑分別增加了5.6和6.3 nm。不同儲(chǔ)藏溫度下,微乳粒徑也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，其中常溫條件更有利于微乳的儲(chǔ)藏。其原因是低溫環(huán)境會(huì)降低顆粒的熱能，在儲(chǔ)藏的過程中顆粒發(fā)生少量聚集，導(dǎo)致體系不穩(wěn)定[23]。

圖8 艾葉精油微乳在不同溫度下儲(chǔ)藏時(shí)的粒徑Fig.8 Particle size in argyi essential oil microemulsion stored at different temperatures

2.7 離心穩(wěn)定性

為了避免微乳液在儲(chǔ)藏、加工和運(yùn)輸過程中發(fā)生顆粒聚集、靜置分層和破乳等現(xiàn)象，采用離心加速法測(cè)試微乳的穩(wěn)定性，選擇低、中和高3種離心速度對(duì)其進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)艾葉精油微乳液在中低離心速度下微乳不分層、不渾濁，其中透光率隨著離心速率的增加而減少，其原因是離心力的增大使其微乳內(nèi)部顆粒聚集成簇，穩(wěn)定性降低[24]。

表2 艾葉精油微乳在不同離心速度下的透光率Table 2 Light transmittance of argyi leaf essential oil microemulsion at different centrifugal speeds

2.8 艾葉精油微乳自由基清除率

DPPH自由基清除率是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的一種簡便快捷、靈敏可行的方法，并常作為檢測(cè)物質(zhì)抗氧化活性的指標(biāo)。由圖9可知，當(dāng)艾葉精油微乳體系含水量<60%時(shí)，DPPH自由基清除率隨著水分含量的增加而快速提高，且DPPH自由基清除率在水分含量為60% 時(shí)達(dá)到最大值。水分含量>60%時(shí)，DPPH自由基清除率隨著水分含量的增加而緩慢降低。其原因是含水量較低時(shí)，體系中的水相被油相所束縛，包埋在反向膠束類，體系中多余的表面活性劑會(huì)阻礙油相(艾葉精油)與DPPH的相互接觸和作用，因此隨著水分含量的增加，反膠束流動(dòng)性提高，油相與DPPH自由基接觸面積增大，則DPPH自由基清除率快速提高[25]。當(dāng)含水量>60% 時(shí)，相同的反應(yīng)體積中的艾葉精油含量進(jìn)一步降低，但DPPH自由基清除率的變化幅度較小，這可能是逐步增加的自由水加速了自由基反應(yīng)所致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[26]研究結(jié)果一致。

圖9 不同含水量艾葉精油微乳自由基清除率的變化Fig.9 Free radical scavenging rates of argyi leaf essential oil with different water content

3 結(jié)論

本研究以艾葉精油為油相，在其表面活性劑和助表面活性劑作用下構(gòu)建了一個(gè)可以提高艾葉精油利用率的四元微乳體系，研究發(fā)現(xiàn)艾葉精油與混合表面活性劑質(zhì)量比為7∶3時(shí)，形成的微乳穩(wěn)定、透亮且粒徑分布在10～100 nm。為了保證該微乳在使用、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程中不發(fā)生質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性、離心穩(wěn)定性和抗氧化性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：常溫條件更適合微乳的儲(chǔ)存。通過抗氧化實(shí)驗(yàn)可知，O/W型微乳能呈現(xiàn)更好的DPPH自由基清除率。本研究研制的艾葉精油微乳劑操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定，是一種天然無污染、實(shí)用低廉的新型保鮮劑，對(duì)艾葉精油微乳功能性食品制劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。