河豚魚皮膠原肽螯合鋅的組成與急性毒性研究

郭洪輝，陳暉，俞云，方華，陳思謹，洪專*

1(自然資源部第三海洋研究所 海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門，361005)2(南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京，210023)

我國是水產加工和消費大國，水產品總量約占世界總產量的1/3，生產加工過程中會產生大量的魚副產物，如魚皮、魚骨、魚鱗、魚頭、內臟、碎肉等，約占原料魚的50%[1]。這些魚副產物中含有豐富的膠原蛋白，是良好的天然蛋白質來源，如果直接廢棄，不僅浪費資源還會增加環境的壓力[2]。目前，已有越來越多的研究關注從魚副產物中提取膠原蛋白、膠原肽并加以開發利用，提高水產加工高值化利用率[3-4]。

水產源膠原蛋白不同于傳統工業牲畜類膠原蛋白，往往具有更高的食用安全性[5]。當與鈣、鋅、鐵等微量元素形成螯合物后，可更好地促進微量元素在人體內的吸收利用[6-7]，緩解微量元素缺乏所引起的并發癥。此外，螯合物還具有抗氧化、抗菌、增強免疫力、降血脂和降血糖等活性，有良好的開發應用前景[8]。

多肽-金屬元素螯合物屬于新型的有機金屬螯合物，盡管構成螯合物的微量元素和多肽都是可食用和安全的，但是也有必要對其毒理學安全性進行科學評估[9]。過量的微量元素攝入會對機體產生危害，如帶魚蛋白亞鐵螯合肽在高劑量組會出現試驗小鼠死亡[10]，通過急性毒性試驗得到其半數致死量(lethal dose 50%,LD50)為7.454 8 g/kg。蛋氨酸鋅在急性毒性試驗期間，高劑量組大鼠全部死亡; 中劑量組大鼠出現部分死亡，測得蛋氨酸鋅的LD50值為2.000 g/kg，屬于低毒級別[11]。目前關于多肽-金屬螯合物的安全性評價數據仍比較缺乏，本研究對河豚魚皮中提取的膠原多肽與鋅的螯合物進行了組成成分分析，并根據《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》，對其毒理學安全性進行初步評價，為河豚魚皮膠原肽螯合鋅的進一步開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚魚皮膠原肽(CP)、河豚魚皮膠原肽螯合鋅(CP-Zn)，實驗室自制[12]；Superdex peptide10/300GL凝膠色譜柱,美國GE 公司；氨基酸分析柱AminoPacPA10 (2 mm×250 mm)、保護柱AminoPacPA10 (2 mm×50 mm)，美國賽默飛世爾科技公司; ICR小鼠(體重18～20 g，實驗動物合格證號SCXK (滬) 2013-0006)，上海杰思捷實驗動物有限公司；標準氨基酸、標準蛋白樣品,Sigma公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1.3 實驗方法

1.3.1 成分測定

水分含量：直接干燥法(GB/T 5009.3—2010)?；曳趾浚厚R弗爐灰化法 (GB/T 5009.4—2010)。粗蛋白含量：微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)。鋅含量：原子吸收光譜法(GB/T 5009.14—2017)。

1.3.2 膠原肽分子質量的測定

1.3.3 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) 檢測

將1 μL 10 mg/mL的樣品水溶液與1 μL基質 [20 mg 2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)溶解于1 mL的體積分數50%乙腈-水溶液中]混勻后，滴于不銹鋼靶上，室溫自然干燥，推入離子源中測定[14]。質譜條件:所用激光為337 nm N2激光光源，激光脈沖3 ns, 加速電壓19.0 kV，反射電壓15.4 kV。譜圖采集模式為正離子反射模式，每張譜圖累計600次。

1.3.4 氨基酸組成檢測

稱取0.1 g樣品，用10 mL的6 mol/L的鹽酸消化完全后，稀釋200倍，用0.44 μm的濾膜過濾備用。采用離子色譜對樣品的氨基酸組成進行分析[15]，以1 mol/L醋酸鈉、250 mmol/L NaOH水溶液為流動相，進樣量10 μL,測定樣品的氨基酸組成和含量。

1.3.5 急性毒性試驗

經預試驗，找出0%、100%動物死亡量后，取健康ICR小鼠50只，體質量18～20 g，雌雄各半。隨機分為5組，每組10只，各組的河豚魚皮膠原肽螯合鋅(CP-Zn)的劑量為4.513 5、5.506 8、6.723 8、8.209 8、10.024 2 g/kg。給藥前，實驗小鼠分籠，全價顆粒飼料喂養，自由飲水，室溫20～25 ℃，實驗室相對濕度60%～70%。試驗前禁食(不禁水)12 h，各組分別按上述劑量一次灌胃給藥10 mL/kg。觀察14 d內動物所發生異常反應、死亡情況及死亡原因，未死亡動物于2周后處死進行尸檢。

1.3.6 統計方法

2 結果與分析

2.1 成分分析

由表1可知，CP的蛋白質質量分數為(92.00±1.20)%，在與鋅離子螯合后，蛋白質質量分數下降為(82.04±0.68)%，含鋅質量分數為(12.86±1.24)%，其蛋白質和鋅的含量相對較高，說明CP與鋅離子有較強的結合能力[16]。

表1 CP和CP-Zn的主要組成成分Table 1 Main composition of CP and CP-Zn

2.2 分子質量分析

采用凝膠色譜對CP和CP-Zn的分子質量分布進行測定，如圖1所示。圖1-a是5種標準蛋白的分子質量分布圖，按照出峰順序，從左到右分別為細胞色素 C (M=12 384)、抑肽酶 (M=6 512)、桿菌肽 A (M=1 422)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸 (M=189)、甘氨酸(M=75)。采用標準蛋白分子質量的對數值對洗脫體積做標準曲線，得到回歸方程：lgM=-0.23V+6.490 2 (R2=0.991 1)。通過洗脫體積可計算樣品的分子質量分布。由圖1-b和圖1-c可知，CP的分子質量組成處在標準相對分子質量的低段，主要集中在1 000 Da以內，為小分子的膠原肽，峰值位置為16.1 mL，其分子質量在600 Da附近。從出峰位置判斷，CP-Zn的分子質量范圍明顯要大于CP的分子質量，分子質量分布在200～3 000 Da，峰值位置為14.3 mL，通過回歸方程可估算其所在的分子質量約為1 500 Da。圖2是CP和CP-Zn的MALDI-TOF 質譜圖，通過質譜圖可以對CP和CP-Zn的分子質量做進一步的判斷。譜圖中的縱坐標為離子豐度，橫坐標為離子的質荷比。經MALDI-TOF 質譜儀測定CP的準分子離子峰[M+H]+均小于1200, 即CP的相對分子質量主要在1 200 Da內，這與凝膠色譜的測定結果較為吻合[17]。圖2-a所示，CP的主峰為質荷比643.243 的離子，對應為[M +H]+，而與鋅離子形成螯合物后，在CP-Zn的質譜圖中，形成了一個電荷的質荷比為707.404 的特征峰，對應為[M-H+Zn]+。對比得出，多肽[M+H]+結合一個鋅變為質荷比為707.404 的峰[M-H+Zn]+，這也表明了多肽螯合鋅的生成[18]。

圖1 標準蛋白(a), CP(b)和CP-Zn(c)的分子質量分布Fig.1 Molecular weight distribution of standard proteins(a), CP(b) and CP-Zn(c)

圖2 CP(a)和CP-Zn(b)的MALDI-TOF 質譜圖Fig.2 MALDI-TOF mass spectra of CP (a) and CP-Zn(b)

2.3 氨基酸組成分析

CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例測定結果如表2所示。CP和CP-Zn中均能檢測出18種氨基酸，其中含量較高的氨基酸分別為甘氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。CP中的甘氨酸含量為12.28%，羥脯氨酸的含量為21.65%，占總氨基酸的比例分別為13.67%和24.09%，與Zn2+螯合后，此2種氨基酸的含量也是較為豐富，這基本符合膠原蛋白的氨基酸組成特點[19]。但是從分析結果上看，河豚魚皮膠原肽中含有豐富的酸性氨基酸，其中天冬氨酸的比例最高為26.16%，谷氨酸為9.27%，與鋅螯合后，其比例均有所增加。由于酸性氨基酸側鏈的羧基具有較強的金屬結合能力，因此天冬氨酸和谷氨酸的羧基很可能成為CP與Zn2+的結合位點[20-21]。CP中總的氨基酸含量為89.86%，而CP-Zn中的氨基酸總含量顯著下降，為81.44%, 這是由于CP-Zn中含有大量的鋅離子所致[16]。

表2 CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例Table 2 Amino acid composition and proportion of CP and CP-Zn

2.4 急性毒性試驗

給予小鼠CP-Zn后，觀察并記錄小鼠體質量變化以及各組小鼠的死亡數。由表3可知，在觀察期間，小鼠的體質量均有明顯增長，但是隨著給藥劑量的增加，小鼠體質量的總增加量呈減少的趨勢。按不同劑量給藥的各組小鼠，除4.513 5 g/kg劑量組外均開始有動物死亡(表4)，而高劑量組(10.024 2 g/kg)的小鼠在給藥后出現活動減少等癥狀并全部死亡；劑量組5.506 8 ～8.209 8 g/kg也出現小鼠不同程度的死亡，給藥劑量增大，小鼠的死亡數也增多。4.513 5 g/kg劑量組的小鼠表現正常。對各劑量組死亡的小鼠及時尸檢，肉眼未見心、肝、脾、肺、腎等臟器的異常改變。各組連續觀察14 d，計算各組動物死亡總數，按Bliss法計算小鼠的LD50及其95%的可信限，得出CP-Zn的LD50為6.847 9 g/kg，95%的可信限為6.122 4～7.676 5 g/kg。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版) 中的急性毒性分級標準，LD50在5.001～15.000 g/kg為實際無毒級別，因此CP-Zn的急性毒性屬于實際無毒。對比補鋅劑ZnSO4的LD50為0.583 2 g/kg[22]，乳酸鋅的LD50為0.977～1.778 g/kg[23]，蛋氨酸鋅的LD50值為2.00 g/kg[11]，葡萄糖酸鋅的LD50值為2.50 g/kg[24]，L-賴氨酸鋅的LD50值為3.512 4 mg/kg[25]，可看出有機鋅的毒副作用明顯較無機鋅小，而CP-Zn的LD50值較大，說明其具有更高的食用安全性，適合進一步開發用于鋅補充劑。

表3 CP-Zn對小鼠體重的影響Table 3 Effect of CP-Zn on body weight of mice

表4 CP-Zn的小鼠經口急性毒性試驗結果Table 4 Acute oral toxicity test of CP-Zn on mice

3 結論

從河豚魚皮中提取制備膠原肽，并與鋅螯合得到河豚魚皮膠原肽螯合鋅。河豚魚皮膠原肽的分子質量基本在1 000 Da以下，主要集中在600 Da附近，為小分子的膠原寡肽，其蛋白質含量為(92.00±1.20)%。氨基酸組成分析顯示，河豚魚皮膠原肽富含甘氨酸、羥脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。河豚魚皮膠原肽螯合鋅的分子質量分布范圍明顯要大于膠原肽，其蛋白含量為(82.04%±0.68)%，鋅含量為(12.86±1.24)%，MALDI-TOF 質譜圖可以說明肽-鋅螯合物的生成。急性毒性試驗結果顯示，河豚魚皮膠原肽螯合鋅的LD50為6.847 9 g/kg，95%的可信限為6.122 4～7.676 5 g/kg，屬于實際無毒級，與傳統補鋅劑ZnSO4、葡萄糖酸鋅相比，具有更高的食用安全性，有望進一步開發河豚魚皮膠原肽螯合鋅在食品和醫藥領域中的應用。