PD-1/PD-L1通路在三陰性乳腺癌預后預測及治療中的意義

張鳳春 ，張碩淵，陳天恩，徐迎春

1. 上海交通大學醫學院附屬蘇州九龍醫院腫瘤科，蘇州 215021；2. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院腫瘤科，上海 200025；3. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院腫瘤科，上海 200127

乳腺癌是危害全球女性健康的常見惡性腫瘤，其中的三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），即雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR） 及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均為陰性的乳腺癌亞型，占全部乳腺癌的15%～20%[1]。TNBC對內分泌治療和抗HER-2靶向治療不敏感，缺乏有效的治療靶點，是乳腺癌中較為兇險和預后較差的亞型，臨床上急需尋找更為有效的新型治療措施。

TNBC具有較多的腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TIL）[2]，高基因組具不穩定性[3]和較高的突變率[4]，使其可以產生較多的新抗原而成為最具免疫原性的乳腺癌亞型。程序性死亡-1（programmed death-1，PD-1）受體是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，由于其與細胞凋亡程序相關而被命名，多表達于激活的T細胞、B細胞及自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）。PD-1及其配體程序性死亡配體-1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、PD-L2通 過 負 性信號調節T細胞的活化、免疫耐受以及免疫介導的組織損傷[5]。PD-L1是B7家族的一員，為跨膜蛋白，廣泛表達于免疫細胞、上皮細胞及血管內皮細胞[6]。許多腫瘤細胞表面也表達PD-L1或在γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）誘導后高度表達PD-L1；當其與受體PD-1結合時，導致腫瘤抗原特異性T細胞凋亡，使腫瘤細胞逃避免疫監控[7]。通過抗PD-1/PD-L1單克隆抗體（單抗）阻斷PD-1/PD-L1途徑可以達到抗腫瘤的效果，為進行抗腫瘤免疫治療提供了可能[8]。目前PD-1/PD-L1相關的研究已經成為腫瘤治療研究的熱點，在TNBC治療領域也初露鋒芒并廣泛開展。PD-L2多表達于巨噬細胞和樹突狀細胞，也表達于腫瘤細胞。相對而言，PD-L2的功能研究尚不成熟。有研究[9]提示PD-L2在抗腫瘤免疫的誘導及效應階段均可以促進CD8陽性T細胞發揮作用。本文著重概述目前PD-1/PD-L1在TNBC預后預測和治療中應用的研究進展，以期為基礎和臨床研究提供理論基礎。

1 PD-1/PD-L1在TNBC中的表達及其與預后的關系

腫瘤組織PD-L1陽性的惡性腫瘤患者預后較差。一項關于乳腺癌的meta分析[10]提示腫瘤細胞PD-L1陽性與不良臨床病理危險因素（如分級為3、高增殖指數、激素受體陰性和TNBC）有關，且與無病生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）短密切相關；TIL的浸潤程度與早期TNBC的DFS和OS相關，同時TIL PD-L1陽性亞組具有更長的DFS和OS；提示PD-L1具有一定的預后預測價值，且不同組織細胞PD-L1的預測意義可能存在差異。現有文獻中關于在乳腺癌中如何用免疫組織化學方法檢測PD-1及PD-L1表達的表述各異，其對預后預測結果往往也不一致，推測可能由于不同研究應用免疫組織化學檢測的抗體種類不同[11]，PD-L1陽性閾值、靶細胞類型（腫瘤細胞、腫瘤間質細胞）、陽性表達細胞組分（細胞膜、細胞質）不同，及乳腺癌本身高度的異質性所致[12]。

1.1 PD-1/PD-L1在TNBC中的表達

2014年，Gatalica等[13]的研究納入了116例乳腺癌患者（含53例TNBC），應用B7同源物1（B7 homologue 1，B7-H1，又稱PD-L1）抗體，以1%中等或強的細胞膜或細胞質染色作為陽性，結果提示TNBC中TIL的PD-1及腫瘤細胞PD-L1的表達均明顯高于HER-2陽性（n=5）、管腔B（n=25）和管腔A（n=33）亞型；相較其他3種乳腺癌亞型，TIL的PD-1及腫瘤細胞PD-L1共表達的比例亦以TNBC為最高，差異均有統計學意義。2017年，Dill等[14]采用組織芯片技術，以PD-L1細胞膜著色≥1%定義為陽性，檢測了245例原發性乳腺癌（其中32%為TNBC）和40例轉移性乳腺癌（淋巴結轉移及遠處轉移各20例），結果顯示PD-L1的表達在不同乳腺癌亞型及腫瘤內存在異質性，主要存在于組織學級別高、激素受體陰性的乳腺癌中。而Mittendorf等[15]以組織芯片的方法，選用PD-L1的5H1抗體檢測了105例TNBC中PD-L1的表達，以陽性細胞＞5%作為界值，發現PD-L1陽性率為19%（20/105）。Dill等[14]的研究發現PD-L1彌漫性著色（＞50%）非常罕見，在全部乳腺癌中僅占2%，在TNBC中僅占5%；由此可見，PD-L1在腫瘤內的表達存在明顯的異質性，粗針穿刺活檢的PD-L1狀態評價可能存在誤判，提倡應用手術組織標本進行PD-L1檢測。

實際上對于TNBC PD-L1檢測的爭議終于在IMpassion130研究[16]結果報道后塵埃落定。該研究對614例TNBC同時對PD-L1的SP142、22C3和SP263抗體進行檢測；對于SP142和SP263抗體，將PD-L1陽性定義為任何強度PD-L1染色的腫瘤浸潤免疫細胞（immune cell，IC）占腫瘤區域（腫瘤細胞、腫瘤內和腫瘤周圍基質）面積的比例≥1%；對于22C3抗體，采用聯合陽性評分（combined positive score，CPS）對PD-L1的表達進行判斷，即PD-L1染色的細胞（腫瘤細胞、淋巴細胞和巨噬細胞）數目相對于腫瘤細胞總數的百分比，將CPS≥1定義為22C3+。結果顯示：3種抗體檢測的PD-L1陽性率分 別 為 46%（SP142）、81%（22C3） 和 75%（SP263）。一致性分析發現：SP142+/22C3-為1%，SP142+/22C3+為45%，SP142-/22C3+為 36%，SP142-/22C3-為 18%； 而SP142+/SP263-為 1%，SP142+/SP263+為 45%，SP142-/SP263+為 30%，SP142-/SP263-為 24%； 提 示 22C3和SP263檢測方法篩選出了較大的可能免疫治療獲益人群，而SP142檢測方法陽性患者僅為上述2種檢測方法陽性患者的一部分。探索性分析發現，SP142 IC陽性亞組與臨床療效相關，因此，SP142 IC檢測方法已經被批準作為診斷性檢測，以甄別最有可能從阿替珠單抗和納米白蛋白結合型紫杉醇聯合治療中獲益的TNBC患者（22C3+/SP142+和SP263+/SP142+人群）[16]。

1.2 PD-1/PD-L1與TNBC的預后

關于PD-1及PD-L1與臨床病理特征關系的研究，Muenst等[17]的研究發現650例乳腺癌（TNBC 127例）中PD-L1陽性表達率為23.4%，其表達與年齡，腫瘤大小、分期、分級，淋巴結轉移狀態，雌激素受體（estrogen receptor，ER）缺失和增殖細胞核抗原Ki-67高表達相關。另有研究[18]亦支持PD-L1表達與高TIL水平及其他預后不良因素，如年輕、高組織學分級、ER陰性、孕激素受體（progesterone receptor，PR）陰性、HER-2過表達、高增殖指數及侵襲性亞型（三陰性、基底細胞樣）等相關。

關于PD-1及PD-L1與預后關系報道不一。Monneur等[18]報道PD-L1表達是一個獨立的影響患者OS的不良因素，亞組分析提示在以TNBC為主的基底細胞型中這種影響更為顯著。一組來自870名中國乳腺癌患者（包含222例TNBC）的研究[19]數據亦支持PD-L1的高表達會對乳腺癌的預后產生不良的影響。另有研究[20]表明，新輔助化學治療（化療）后未達到病理學完全緩解的殘留腫瘤組織中PD-L1的表達與局部晚期乳腺癌較差的預后有關，尤其是TNBC亞型。2017年有文獻[21]報道了PD-L1和TILs聯合分析在TNBC中的關系，證實在PD-L1陽性患者中如果同時伴有TILs低浸潤則具有更高的復發和死亡風險。2018年Tomioka等[22]的研究獲得類似結果，他們應用免疫組織化學方法檢測了22例TNBC患者新輔助治療前后腫瘤細胞PD-L1的表達；空心針穿刺活檢的標本中，13例陽性率低于10%，9例陽性率高于10%；新輔助治療后的手術標本中，19例陽性率低于10%，3例陽性率高于10%，提示新輔助治療下調了PD-L1表達。該研究[22]同時檢測了腫瘤微環境中TIL的分布，結果提示在TIL小于30%的亞組，新輔助治療前PD-L1高表達（高于10%）者預后不良，DFS和OS較PD-L1低表達者明顯下降。2017年的一篇納入8 583例各亞型乳腺癌患者的meta分析表明，PD-L1過表達與無轉移生存、DFS并無關系，但是與OS有顯著關聯，提示PD-L1過表達可能會增加病死率[23]，其機制可能為PD-L1的高表達可促進乳腺癌細胞的免疫逃逸[24]。

然而也有研究[25]發現，PD-L1對于TNBC的預后是一個積極的影響因素。2016年Bae等[26]的研究證實，PD-L1的表達有利于乳腺癌患者（TNBC 109例，占23.4%）的PFS和OS，但該因素不是一個獨立的預后影響因素。同年又有研究[27]表明，盡管PD-L1的表達與乳腺癌不良的臨床及病理特征相關，但是更有利于OS。另一項基于136例TNBC的研究[28]也提示間質中PD-L1陽性表達組與陰性表達組相比，DFS明顯延長。此外，在包含238例TNBC的研究[12]中也發現腫瘤細胞中PD-L1的表達對于DFS是一個積極的影響因素，PD-L1陽性組的DFS明顯延長，但PD-L1表達與OS無關。一項納入45例乳腺癌患者（包含TNBC 15例）的研究[29]中，全部乳腺癌患者中78%存在TILs PD-L1陽性，而只有21%存在腫瘤細胞PD-L1陽性；在PD-L1陽性表達的腫瘤中，存在TILs浸潤和存在外周血淋巴細胞活化的比例遠高于PD-L1陰性表達組（89% vs 24%，100% vs 41%），說明腫瘤細胞的PD-L1表達可提示乳腺癌的免疫活化狀態，部分解釋了其作為一個預后良好因素的機制。PD-L1廣泛表達于TNBC細胞膜（64%）、細胞質（80%）和間質（93%）；細胞質PD-L1高表達與低TNBC特異性死亡風險相關（HR=0.450，P=0.035），而間質PD-L1高表達與低全因死亡風險相關（HR=0.305，P=0.004），細胞膜PD-L1表達與預后不相關[30]。乳腺癌原發及轉移病灶標本具有不同的免疫原性[31]。TNBC原發病灶PD-L1陽性率與轉移病灶比較可能存在一定差異。

綜上，PD-1/PD-L1對于TNBC預后的預測有著重要的作用，但TNBC本身具有較大的異質性，該預測作用在不同亞型中可能存在差異。現有的研究報道爭議頗多，且還有研究[32]依據免疫細胞活化或抑制相關的29個基因（如CD8A等）將TNBC劃分為免疫原性高、中、低不同亞組以預測免疫治療效果，但這些研究和分型還有待進一步臨床驗證。

2 PD-1/PD-L1在TNBC中的表達及其與療效的關系

對于TNBC患者，目前的主要治療方案還是以手術和化療為主。由于TNBC及其微環境中具有相對高的PD-L1水平，以PD-1/PD-L1為靶點的臨床免疫治療已經成為TNBC抗腫瘤治療的新趨勢[33]。Hartkopf等[34]在2016年的研究中證實，阻斷PD-L1的治療對于TNBC亞型有利于長期疾病控制。目前，已有多個抗PD-1、PD-L1及細胞毒T淋巴細胞相關抗原 -4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）的單抗及其聯合治療進入臨床試驗。現在已有5個PD-1/PD-L1通路相關的臨床藥物，分別是抗PD-1的Pembrolizumab、Nivolumab和抗 PD-L1的Atezolizumab、Avelumab和 Durvalumab；涵蓋了新輔助治療、輔助治療和解救治療等層面，甚至應用于一些特殊類型少見群體，如腦轉移患者群等，從而使更多TNBC患者的臨床免疫治療獲益成為可能。

2.1 單藥治療

初期的臨床探索多集中于免疫單藥治療多線治療失敗以后的晚期TNBC。Pembrolizumab的Ⅰ b期多中心臨床試驗 KEYNOTE-12（NCT01848834）[35]為轉移性 TNBC的治療帶來了突破；TNBC作為研究中一個隊列，共計111例進行了PD-L1表達篩查，58.6%的患者為PD-L1陽性；最終32例入組，87.5%曾接受過新輔助化療或輔助治療，46.9%的患者接受了至少3線解救化療，25.0%的患者接受過至少5線治療，Pembrolizumab（劑量10 mg/kg，每2周1次）中位給藥劑量為5 mg/kg（1～36 劑），中位持續時間為59.5 d（1～530 d）；在27例可評估療效的患者中，客觀緩解率（objective response rate，ORR）為18.5%（5/27），完全緩解率為3.7%（1/27），部分緩解率為14.8%（4/27），疾病控制率25.9%（7/27），疾病進展率為74.1%（20/27），實現緩解的中位時間為17.9周（范圍7～32周）；常見的不良反應為輕度的疲勞、惡心和關節肌肉疼痛，32例患者中有5例出現了3度毒性反應，1例死于治療相關的彌漫性血管內凝血。KEYNOTE-012為PD-L1陽性復發難治的TNBC免疫治療進行了初步探索，臨床獲益25.9%（7/27）[35]，不良反應可耐受。此后開展的Ⅱ期臨床研究KEYNOTE-086[36]納入轉移性TNBC 170例，其中PD-L1陽性占61.8%，接受3線及以上治療占43.5%，每3周靜脈注射Pembrolizumab 200 mg連續2年；結果提示：總體和PD-L1陽性患者的ORR為5.3%、5.7% ，疾病控制率分別為7.6%、9.5%；PD-L1表達與否與Pembrolizumab療效無顯著相關性；無治療相關死亡，顯示其在TNBC免疫治療具有初步療效和可控的安全性。Pembrolizumab對比單藥化療用于二線及以上TNBC的Ⅲ期隨機對照臨床研究（KEYNOTE-119）[37]結果顯示，與化療相比，Pembrolizumab并未顯著改善患者的OS，但PDL1 CPS≥20%的亞群（占18.5%）的OS明顯提高，差異具有統計學意義（HR=0.58，95% CI為0.38～0.88）。

2015年美國癌癥研究學會年會公布了Atezolizumab治療（15或20 mg/kg，每3周1次，持續1年）轉移性TNBC的多中心Ⅰ期臨床研究（NCT01375842）的進展：截至2014年7月21日，入組27例，21例可評估療效，ORR 24%，3～5級不良反應發生率為11%，其中1例為5度肺動脈高壓[38]。該研究[38]中，PD-L1陽性定義為IC占比≥5%。擴大樣本量的研究[39]后續發布于2017年美國癌癥研究學會年會，共計入組了115例TNBC，112例可評估療效，含一線治療19例、二線及以上治療93例；依據實體腫瘤療效評價標準，共11例（10%）患者對治療有應答，而在PD-L1陽性亞組（IC評分2/3）中應答率提高至13%（9/71）；對Atezolizumab治療有/無應答者的OS存在差異，且對Atezolizumab治療有應答者的中位緩解持續時間長達21個月；提示Atezolizumab治療對于一線及多線治療后的部分TNBC均可能產生持久的治療應答，并且具有較好的安全性，為免疫治療在TNBC患者中的治療應用提供了更多的證據。在2018年關于抗PD-L1單抗臨床Ⅰ期試驗（NCT01772004）的報道[40]中，Avelumab在58例TNBC患者中的ORR僅為5.2%，但在9例PD-L1陽性表達的TNBC患者中，ORR可高達22.2% 。

以上臨床試驗都提示在一定程度上抗PD-1/PD-L1單抗對于TNBC具有緩解作用。PD-L1高表達及TIL陽性[41]可能是免疫檢查點抑制劑治療有效的輔助篩選指標。但抗PD-L1抗體在治療癌癥的過程中由于激活免疫系統所導致的自身免疫疾病[42-43]及其他不良反應需引起重視。

2.2 聯合治療

在實驗室研究和臨床應用中，單一免疫檢查點抑制劑的ORR并不令人滿意。故先采用放射治療（放療）或化療誘導治療，或同步采用放療、化療和靶向治療等，促進腫瘤細胞壞死后新抗原釋放，以期改善患者的免疫治療反應率。

TONIC研究[44]先采用放療或多柔比星、環磷酰胺、順鉑化療誘導治療，然后給予抗PD-1藥物Nivolumab治療（3 mg/kg，每2周1次），與未處理直接免疫治療組相比，多柔比星誘導組的ORR最佳（達35%），其次為順鉑組（達23%）；腫瘤組織中的CD8陽性的T淋巴細胞比例越高，免疫治療的緩解率越高。Atezolizumab聯合白蛋白紫杉醇治療33例TNBC的Ⅰ b期臨床研究（NCT01633970）報道聯合治療總ORR 42%，一線治療、二線治療的ORR分別為54%、30%[45]，提示免疫治療早期應用可得到更大獲益。一項來自41個國家的Ⅲ期臨床試驗（IMpassion130）[46]中，902名未接受過治療的轉移性TNBC患者被1:1隨機分組，接受Atezolizumab或安慰劑聯用納米白蛋白結合型紫杉醇治療，結果顯示：Atezolizumab聯合治療組（試驗組）的中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）為7.2個月，安慰劑聯合治療組（對照組）為5.5個月，Atezolizumab聯合治療組的疾病進展或死亡風險降低20%；試驗組和對照組的中位OS分別為21.3個月和17.6個月，試驗組的死亡風險降低16%。在共計369名PD-L1陽性（PD-L1 IC陽性率≥1%）的患者中，試驗組和對照組的中位PFS分別為7.5個月和5.0個月，試驗組的疾病進展或死亡風險降低38%；2組中位OS分別為25.0個月和15.5個月，試驗組的死亡風險降低38%。此外，試驗中沒有發現新的不良反應。與標準治療單獨化療相比，該研究[46]首次證明了免疫療法和化療聯合能夠顯著延長生存期。在新輔助治療的I-SPY 2臨床試驗中，Pembrolizumab聯合標準化療顯著提高了TNBC患者的腫瘤反應率，與接受標準治療的患者對比，Pembrolizumab聯合治療組的病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）由20%提高到60%[47]。另一項多中心前瞻隨機雙盲安慰劑對照Ⅱ期研究（NCT02685059）中，174例早期TNBC患者（其中117例參與窗口期）被1:1隨機分組，給予納米白蛋白結合型紫杉醇＋表柔比星＋環磷酰胺標準術前新輔助化療，每4周給予Durvalumab或安慰劑，結果顯示：Durvalumab組pCR為53.4%，安慰劑組為44.2%（OR=1.45，P=0.287）；對于參與窗口期患者，Durvalumab組與安慰劑組pCR分別為61.0%與41.4%（OR=2.22，P=0.048）；結果表明，蒽環類聯合紫杉類新輔助化療＋Durvalumab可以提高患者的pCR，尤其是化療開始前單用Durvalumab治療的患者[48]。此外，在一項Ⅲ期隨機雙盲試驗（KEYNOTE-522，NCT03036488）[49]中，新輔助Pembrolizumab聯合化療組（KEYTRUDA方案，n=401）與新輔助化療組（化療-安慰劑方案，n=201）比較，pCR顯著增加（51.2% vs 64.8%，P=0.001）；在無事件生存率（event free survival，EFS）方面，中位隨訪時間15.5個月時，與化療-安慰劑方案相比，KEYTRUDA方案將新輔助期進展和輔助期復發的風險降低了37%（HR=0.63） 。旨在探索Pembrolizumab與化療藥物在新輔助治療中的療效和安全性的研究（Keynote 173與Keynote 522）仍在進行中（NCT02622074）。

目前，免疫治療聯合放療（NCT02730130、NCT02303990）、聯合化療（NCT02499367）、聯合靶向HER-2治療（NCT03168880）、聯合其他免疫治療（NCT01928394、NCT02475213）、聯合MEK1/2抑制劑治療（TBCRC047）及聯合聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑靶向治療（DORA、MEDIOLA、 TOPACIO）的臨床試驗正在進行中；免疫治療聯合放療（NCT02303366）、聯合靶向血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療（NCT00733408）、聯合其他免疫治療（NCT02381314）的臨床試驗已結束，結果待后續公布。靶向調節T細胞的新型免疫治療藥物的臨床研究也正在進行中，如：抗PD-L1+激動劑4-1BB（CD137）或激動劑OX40治療TNBC 的Ⅰ b/Ⅱ期臨床研究（NCT02554812）、CA-170 [抗PD-L1/PD-L2、抗T細胞活化的V結構域免疫球蛋白抑制劑（V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA） ] 治療TNBC的Ⅰ期臨床研究（NCT02812875）以及抗-LAG-3+紫杉醇用于轉移性乳腺癌的Ⅱb期臨床研究（NCT02614833）。

3 總結

綜上所述，PD-1/PD-L1作為腫瘤研究領域的一個熱點，因為其在腫瘤細胞表面的高度表達和對T細胞的調控，使得其成為一種治療癌癥的新的突破點。其既可以作為藥物靶點，也可以作為一項可能的預后指標應用于TNBC。雖然目前對于PD-1/PD-L1 在TNBC等癌癥中的研究和臨床應用越來越多，但是不可否認其中存在一些待解決的問題。首先，免疫相關的不良反應可累計多個系統，主要為皮膚、消化道、肝臟、內分泌以及呼吸系統，其中以皮膚出現不良反應最為常見。在臨床應用時，要嚴格控制劑量并及時監測患者的治療情況，如有必要給予糖皮質激素等免疫抑制劑來防止嚴重并發癥的發生。其次，不同腫瘤患者對于抗PD-L1 單抗治療的反應不同，預后效果和PD-L1 在腫瘤細胞中的表達沒有絕對關系，尚沒有一個有效的指標去監測患者治療反應，今后的臨床研究將更為關注療效預測標志物的探索。最后，抗PDL1 抗體治療TNBC還處在一個起步階段，多為Ⅰ/Ⅱ期探索性研究，主要集中于復發轉移晚期患者，最有效的劑量和是否需要聯合其他化療藥物，對于新輔助及輔助階段應用的可行性等都需要更多的研究和臨床實驗才能證實。