單核-巨噬細胞在抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎中作用的研究進展

安曉寧，陳永熙

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院腎內科,上海 200025

抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）是一類累及全身多系統的自身免疫性疾病，以小血管壁的炎癥及纖維素樣壞死為主要病理特征。在AAV患者中，ANCA致病靶抗原主要為髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和蛋白酶3（proteinase 3，PR3），在中性粒細胞初級顆粒和單核細胞過氧化物酶陽性的顆粒中均有表達。除此之外，彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、陽離子蛋白及人溶酶體相關膜蛋白2與ANCA也存在反應性[1]。AAV包括肉芽腫性多血管炎（granulomatosis with polyangiitis，GPA）、顯微鏡下多血管炎（microscopic polyangiitis，MPA）和嗜酸性肉芽腫性多血管炎（eosinophilic granulomatosis with polyangiitis，EGPA）[2]。

AAV非罕見病，其發病與遺傳、感染、藥物等多種因素有關。全基因組關聯研究顯示AAV與遺傳因素有關[3-4]，如PR3-ANCA血管炎發病主要與HLA-DP、PRTN3及SERPINA1等基因相關，而MPO-ANCA血管炎則與HLADQ多態性相關。此外，感染誘發的自身抗原互補肽和分子模擬[5-6]可在炎癥狀態下誘導ANCA產生。AAV在病變早期不典型，若未得到及時診治，預后差且死亡率高。研究數據表明，AAV患者的5年存活率為75%左右[7-12]。傳統理論認為AAV發病與中性粒細胞密切相關，研究[13-14]還表明單核 - 巨噬細胞在AAV的發病過程中也發揮了重要作用。本文主要圍繞單核 - 巨噬細胞在AAV發病中作用及可能機制進行綜述，為進一步認識本病提供基礎。

1 單核 - 巨噬細胞概述

1.1 單核細胞與巨噬細胞分類及特點

單核細胞發育自骨髓，在集落刺激因子作用下，進入外周血液循環，發育為成熟單核細胞。根據表面標志及其表達量的不同，發育結果亦有差異，在人體內根據表面分化抗原CD14和CD16分子表達強度的不同分為3類：經典型（CD14hiCD16neg/low）、中間型（CD14hiCD16hi）及非經典型（CD14lowCD16hi）；而在小鼠體內，單核細胞的標志性分子為LY6C，LY6C高表達和LY6C低表達的單核細胞分別對應人單核細胞中的經典型和中間型[15]。人單核細胞中經典型占多數，在促炎反應和抗菌作用中起重要作用；中間型具有促炎作用，而非經典型具有血管巡視和抗病毒的功能。單核細胞在生理或病理條件下可分化為樹突細胞或巨噬細胞，其中經典型單核細胞是樹突細胞的主要來源，但所有的亞型都能分化為巨噬細胞[16]。

巨噬細胞是固有免疫的重要成分，屬于髓系免疫細胞，位于全身各組織。根據激活方式，分為經典激活巨噬細胞（classic macrophage，M1巨噬細胞）和替代激活巨噬細胞（alternative macrophage，M2巨噬細胞）。M1巨噬細胞促進組織損傷，M2巨噬細胞則可促進組織修復。在刺激因子作用下，M2巨噬細胞又可分為M2a、M2b、M2c巨噬細胞3種亞型。巨噬細胞具有強大的吞噬功能，可吞噬內源或外源性致病物質，加工提呈抗原，同時分泌多種酶、細胞因子等，廣泛參與抗感染、抗腫瘤、組織修復及免疫調節等。

1.2 單核細胞分化與巨噬細胞極化

CD14+及LY6C+單核細胞具有遷移能力。機體處于穩態環境時，單核細胞可不分化為巨噬或樹突細胞而遷移到淋巴或非淋巴器官，同時轉錄模式發生改變。發生炎癥或損傷時，單核細胞遷移活動顯著增強，獲得合成分泌炎癥介質的能力，轉變為巨噬細胞，稱為炎癥巨噬細胞。此外，多數組織在正常條件下同樣存在巨噬細胞群體，在特定組織內具有特定名字，如庫普弗細胞、肺泡巨噬細胞、小膠質細胞等。早期認為，這些組織特異性巨噬細胞由骨髓源性單核細胞發育而來；近來研究[17]表明，這些細胞起源于胚胎形成期，出生后主要通過自我更新維持細胞數量，其產生和維持與持續造血無關。

巨噬細胞極化是指巨噬細胞在特定空間和時間點被激活，表現不同表型及功能，不同微環境可極化為不同表型和功能的巨噬細胞[18-20]。M1細胞可被干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等細胞因子激活，釋放多種致炎因子，如TNF-α、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-12、 精 氨 酸 酶 -1（arginase-1，Arg-1）等。Arg-1代謝可產生高水平的誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）。M2細胞可由IL-1β、IL-13等因子刺激后產生，表達IL-1、IL-10、Arg-1、CD206、CD68、CD86、CD163、甘露糖受體等。根據刺激因子的不同，M2型細胞進一步分為多種亞型，包括IL-4或IL-13誘導的M2a，免疫復合物及部分Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）配體誘導的M2b，IL-10、糖皮質激素或開環甾體類激素誘導的M2c。

2 單核 - 巨噬細胞與AAV研究進展

2.1 單核細胞與AAV

2.1.1 單核細胞表達ANCA抗原 ANCA抗原不僅表達在中性粒細胞胞漿，也表達在單核細胞過氧化物酶陽性的溶酶體中[1]；炎癥時單核細胞抗原表達增加。體外研究[21]表明，用TNF-α刺激單核細胞，其表達MPO及PR3增加；用MPO-ANCA孵育單核細胞，裂解細胞后上清液中游離MPO減少，同時伴隨膜表面MPO表達升高[22]，說明在ANCA作用下胞漿內MPO向膜上轉移。在3種單核細胞亞型中，中間型單核細胞較其他兩型數量顯著增加，MPO和PR3優先在中間型單核細胞中表達，表明中間型單核細胞在疾病進展中可能發揮了較為重要的作用[23]。

2.1.2 單核細胞參與AAV組織損傷及炎癥反應 在體內，AAV患者單核細胞黏附分子表達增加[24]；在體外，ANCA可刺激單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-8、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其他促炎因子的產生增加[21,25-26]。MPO-ANCA使單核細胞在LPS刺激下產生的IL-10水平下降[22]；由于IL-10抗炎作用明確，提示ANCA可能通過減少抗炎IL-10分泌來促進炎癥進展。動物實驗[27]的結果也支持單核細胞參與AAV進程的觀點，單核細胞耗竭及MPOANCA被動轉移模型表明，單核細胞耗竭可顯著減少腎臟腎小球壞死和新月體形成，并減少單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞在腎臟組織中的浸潤。

2.1.3 ANCA刺激單核細胞效應 在ANCA刺激單核細胞釋放IL-8的研究中，與完整的PR3-ANCA相比，Fab及F（ab'）2不能誘導IL-8釋放[25]，提示Fc段在PR3-ANCA激活單核細胞釋放IL-8中的重要性，這一結果與單核細胞Fcγ受體交聯可誘導IL-8釋放的研究結果一致[25,28]。在ANCA誘導單核細胞形成ROS的研究中，ANCA的F（ab'）2段誘導單核細胞形成ROS的能力與完整ANCA相比無明顯差異，而用Fcγ受體抗體預處理單核細胞后，ROS的形成下降[21]，表明Fcγ交聯在細胞激活中的重要性。然而，以上研究表明，F（ab'）2在單核細胞激活中的作用存在爭議。在AAV與TLR的研究中，AAV患者的單核細胞表達TLR2和TLR4的水平升高，而ANCA體外刺激正常單核細胞未見TLR表達的明顯變化[29]。由于TLR信號通路在感染中發揮重要作用，提示AAV中單核細胞的激活可能與體內炎癥有關，并通過TLR通路導致進一步損傷。

2.2 巨噬細胞與AAV

腎臟是AAV常見受累器官之一，在腎活檢標本中可發現大量巨噬細胞浸潤[30]，且巨噬細胞主要浸潤在腎小球中。這些結果表明巨噬細胞可能在腎損害中發揮重要作用。此外，炎癥腎組織中可檢測到巨噬細胞增殖標志物，說明除炎癥募集之外，細胞增殖也是造成局部巨噬細胞浸潤的原因之一，炎癥部位巨噬細胞增殖可能是損傷加重的重要機制[31]。

2.2.1 巨噬細胞釋放MPO參與AAV組織損傷 單核細胞對ANCA有反應性，但巨噬細胞經ANCA作用無反應性。正常人外周血單核細胞有明確的抗MPO-ANCA和抗PR3-ANCA胞漿染色。而體外培養的單核細胞在分化為巨噬細胞時逐漸失去了與抗MPO-ANCA和抗PR3-ANCA的反應性[32]。肺泡巨噬細胞和腹腔巨噬細胞為成熟的組織巨噬細胞，二者均不與MPO-ANCA或PR3-ANCA反應。這些結果表明，ANCA只能與單核細胞直接相互作用，不能與成熟的巨噬細胞直接作用。可能在AAV早期，ANCA激活了單核細胞及早期巨噬細胞誘發炎癥。

另一項關于MPO參與ANCA相關腎小球腎炎的研究顯示腎組織中部分巨噬細胞表達釋放MPO，通過CD68與染色質成分共定位證實了中性粒細胞彈性蛋白酶陰性的胞外陷阱樣結構為巨噬細胞來源，即巨噬細胞參與形成巨噬細胞胞外陷阱（macrophage extracellulartrap like structures，METs）[33]。MPO具有生物活性，對周圍組織可產生氧化損傷[34]，在ANCA被動誘導腎小球損傷的動物模型中，MPO敲除小鼠由于缺乏與ANCA相互作用的自身靶抗原，腎小球損傷明顯減輕[35]。以上研究表明，由單核細胞分化而來的巨噬細胞仍可表達釋放具有活性的MPO，但此時的MPO不再與ANCA反應，而是在胞外直接造成損害或通過形成METs參與損傷。

2.2.2 巨噬細胞極化與AAV 在AAV炎癥微環境中，巨噬細胞可極化為多種表型和功能不同的亞型，在AAV進展中發揮不同作用。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulatory factor，M-CSF）是單核細胞和巨噬細胞生存分化的關鍵因子，研究[36]顯示，抗MPO-ANCA通過增加M-CSF表達，促進單核細胞存活和向巨噬細胞分化，且CD206表達增加，表明巨噬細胞具有M2表型。新月體腎炎活動期，發現大量CD163+細胞，且CD163+細胞與新月體百分率、腎小球濾過率、蛋白尿密切相關[37]，提示M2巨噬細胞參與腎功能不全、新月體腎小球腎炎的發生。AAV患者血清可誘導巨噬細胞向M2c極化[38]，已知M2c細胞能有效吞噬凋亡細胞，因此AAV中M2c表達增高可能與組織在疾病中損傷修復有密切關系。2.2.3 生物標志物與AAV 巨噬細胞遷移抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）是巨噬細胞釋放的一種炎癥介質。MIF在一些自身免疫性疾病中的作用已經得到證實，循環中MIF水平與AAV活動密切相關。MIF在體內具有趨化作用，特別是促進中性粒細胞向炎癥部位遷移。研究[39]證實MIF通過增加ANCA抗原易位來激活中性粒細胞，導致呼吸爆發和脫顆粒，提示MIF阻斷是控制ANCA激活中性粒細胞所致炎癥損傷的潛在治療靶點。

單核 - 巨噬細胞浸潤腎小球和間質在腎血管炎發病中具有作用，細胞浸潤強度與疾病的嚴重程度有關。趨化因子特別是MCP-1，對單核 - 巨噬細胞有較強的體內外趨化作用[40]。MCP-1在血管炎患者腎活檢中表達增加。在AAV中，活動性腎炎患者尿MCP-1水平顯著高于無腎損害者，治療后尿MCP-1水平明顯下降，且尿MCP-1與腎小球巨噬細胞浸潤之間存在顯著相關性[41]。此外，MCP-1還被證明是鑒別AAV活動性腎損害和緩解期較好的尿標志物之一[42]。

CD163是單核 - 巨噬細胞譜系高度特異的標志物，尿可溶性CD163（usCD163）水平升高與腎巨噬細胞浸潤密切相關。研究[43]表明在小血管炎中，活動性腎小球腎炎患者usCD163水平明顯升高；但在活動期腎血管炎患者中，仍有部分患者表現為陰性。將usCD163和尿單核細胞趨化蛋白 -1（urinary monocyte chemoattractant protein-1，uMCP-1）及蛋白尿結合在一起有助于診斷AAV隱匿性腎臟病變，提高診斷準確性[44]。另有研究[45]認為，尿中CD4+效應記憶T細胞增多反映了活動性腎血管炎疾病，故T細胞活化標志物被認為是潛在的疾病活動標志物，如CD25，可將其與CD163進行聯合檢測。結果表明，尿可溶性CD25（usCD25）和血可溶性CD25（ssCD25）在AAV患者活動性腎血管炎的檢測中起到了補充usCD163的作用，兩者水平的升高反映了AAV患者腎血管炎的早期發展，對早期診斷活動性腎血管炎具有重要的臨床意義。

3 單核 - 巨噬細胞為靶點的AAV的治療進展

隨著單核 - 巨噬細胞參與AAV發展的證據增多，近年來針對單核 - 巨噬細胞及其衍生因子的治療方法成為了研究熱點。

單核細胞在AAV緩解期存在持續活化，阻斷其持續活化的治療對維持期AAV患者的緩解有益。CD14為單核細胞重要的標志分子，鈣衛蛋白（calprotectin）可由單核-巨噬細胞產生，在AAV患者中其水平升高可導致腎功能惡化、ANCA表達增加[46]。研究發現兩者參與了感染和自身免疫之間免疫應答的相互干擾，可能在AAV的炎癥放大過程中起著關鍵作用。在AAV緩解期，2種分子都處于上調狀態[47-48]，抗CD14單克隆抗體可作為減輕炎癥方法[49]，在AAV中的作用有待進一步研究。研究[50]發現活動性AAV患者血清鈣衛蛋白升高，緩解期下降但未達到正常水平時提示存在亞臨床炎癥。在AAV常規治療方法中，監測血清鈣衛蛋白變化有助于預測AAV的緩解后復發[51]。使用利妥昔單抗治療的AAV患者，若治療早期未能控制鈣衛蛋白使其下降則復發率明顯升高；對PR3-ANCA患者的分析表明，治療期間未復發的患者血清鈣衛蛋白水平在免疫抑制治療早期顯著降低。由于利妥昔單抗越來越多地用于PR3-ANCA陽性患者復發時的緩解誘導，鈣衛蛋白水平可能有助于確定需要強化或長期治療的患者。

除單核細胞外，針對其衍生細胞因子的治療是另一種有效方法。在AAV患者血清及活動部位中單核細胞產生的IL-6表達升高，而研究發現IL-6受體的單克隆抗體對伴有過敏或難治性患者有效[52]。IL-1和TNF-α均參與AAV病理過程。ANCA相關腎小球腎炎活檢中活化的單核-巨噬細胞TNF-α和IL-1染色陽性[53]，2種細胞因子均能介導實驗性新月體性腎炎腎小球損傷。可用IL-1受體拮抗劑或TNF-α阻斷劑來治療疾病[54]。在吞噬細胞NADPH氧化酶（phagocyte NADPH oxidase，Phox）缺乏小鼠的實驗中，IL-1受體阻斷劑Anakinra顯著降低了ANCA誘導的壞死性新月體性腎小球腎炎的病理損傷及炎癥細胞的浸潤[55]。在ANCA作用下，敲除Phox可促進單核細胞浸潤及炎癥因子釋放，并加重病變。因此，這項研究提示我們IL-1受體阻斷劑對活動性AAV可能是潛在的治療手段。關于TNF-α阻斷劑在AAV及腎小球腎炎中的作用存在一些爭議。在韋格納肉芽腫依那西普試驗（Wegener's granulomatosis etanercept trial，WGET）中，與標準療法相比，聯合依那西普治療沒有任何獲益[56]。此外，自TNF阻斷劑引入以來，陸續有藥物性血管炎報道出現。由于這些原因，有學者認為抗TNF-α治療AAV并不是值得推廣的方法[57]。然而，應考慮到每種療法都有其局限性，特別在WGET研究中，在中重度患者中使用依那西普療效不佳可能是由于這部分患者對常規治療反應好，故抗TNF-α療效不明顯。因此，抗TNF-α治療仍有可能在AAV的治療中發揮作用，可能對難治性AAV，或者在誘導期作為一種類固醇保護劑使用[58]。

4 展望

單核 - 巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，單核細胞內含有ANCA靶抗原，通過與ANCA相互反應，參與AAV的發生和發展。在炎癥因子作用下，單核細胞表面PR3及MPO的表達增加，但是否直接導致循環中ANCA的增加，有待進一步研究證實。巨噬細胞在成熟過程中失去與ANCA直接反應的能力，通過與炎癥微環境相互作用，極化為不同亞型，其中M2型巨噬細胞在AAV以及ANCA相關腎損害中發揮優勢作用。此外，與單核 - 巨噬細胞相關的一些分子參與了AAV的發展，有望成為診斷指標或治療靶點。