苦瓜青錢柳復合茶對秀麗線蟲的抗氧化作用

林春秀，林伊梓，沈少丹，滕巧巧，曹 庸，陳運嬌*

1(廣東省功能食品活性物重點實驗室(華南農業大學)，廣東 廣州，510642)2(華南農業大學 食品學院，廣東 廣州，510642)3(廣東嶺南現代農業實驗室，廣東 廣州，510642)

過量活性氧誘導的氧化應激是導致細胞結構和生物分子功能損傷的重要原因[1]。近年來越來越多的研究發現許多富含生物活性物質的植物提取物表現出很強的抗氧化活性，可以緩解氧化應激[2]，且它們被認為比商業合成的抗氧化劑更經濟、更安全[3]。此外，含有多種植物成分的復合物可能具有更高的藥用價值和/或較低的毒性[4-5]。因此，天然植物抗氧化劑作為食品添加劑、功能性食品和保健食品的潛力受到了人們的廣泛關注。

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)為胡桃科、青錢柳屬植物[6]。在1999年，青錢柳葉茶成為中國第一個通過美國食品藥品管理局認證的保健茶[7]。因其藥用價值，目前已經被列入中國新食品資源名單[8]。有研究表明，多糖是青錢柳葉的主要活性成分，具有一系列獨特的生物活性，如抗氧化、免疫調節和降血糖作用等[9-10]。根據前期研究得知，青錢柳多糖粗提物可通過激活秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，以下簡稱線蟲)的抗氧化防御系統，從而提高抗逆性[11]。苦瓜(Momordicacharantia)，俗稱涼瓜、癩瓜，也是一種藥食同源的植物[12]。苦瓜皂苷不僅具有降血糖、調節糖脂代謝和抗肥胖的藥理作用和保健價值，還具有提高免疫力、抗氧化和抗逆等作用[12]。但苦瓜獨特的苦味，極大地限制了其開發利用。課題組研究發現青錢柳多糖提取物能很好地協調苦瓜皂苷提取物的苦味，基于此，課題組前期以青錢柳多糖和苦瓜皂苷提取物為原料，自主研制了一款新型復合茶——苦瓜青錢柳復合保健茶(專利申請號：CN 108935842 A)。

本研究采用線蟲模型測定苦瓜青錢柳復合茶的抗氧化應激作用，分析其在不同氧化應激模型的生存率，進一步測定其對線蟲抗氧化防御體系及相關基因表達的影響。研究結果為苦瓜青錢柳復合保健茶的抗氧化應激功效提供了有效的理論數據，并增加青錢柳和苦瓜的價值，也對今后研發具有高效、無毒、天然的植物類保健品有著十分重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳干葉，湖南省張家界諾康生態茶業有限公司；苦瓜干片，廣州康圣藥業有限公司；甜菊糖、木糖醇、檸檬酸，均為食品級，當地超市，符合GB 2760—2014要求；二氯百草枯(paraquat)，美國Sigma-Aldrich有限公司；生化分析試劑盒,南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 苦瓜青錢柳復合茶的制備和涂布

原料的制備：按照先前報道的方法，制備青錢柳多糖提取物[11]和苦瓜皂苷提取物[13]的儲備液。

青錢柳多糖儲備液的特征：青錢柳多糖的平均分子質量主要集中在84 061.23 Da，占58%，其次是1 312.41 Da，占29%。真空冷凍干燥后，將樣品重懸于超純水中(水溶性多糖質量濃度137.46 μg/mL)，并保存在-20 ℃下以獲得儲備液[11]。

苦瓜皂苷儲備液的特征：先前的研究初步確定了苦瓜皂苷提取物中含有14種苦瓜皂苷，其中aglycone of momordicoside I、goyaglycoside d、momordicoside P和momordicine I是檢測到的主要成分，儲備液以25.09 mg/mL的質量濃度儲存在-20 ℃(其中皂苷質量濃度為726.23 μg/mL人參皂苷Rg1當量)[13]。

保健茶儲備液的制備：在初始預實驗的基礎上，通過單因素試驗考察青錢柳多糖、苦瓜皂苷、檸檬酸和木糖醇的添加量對保健茶的感官評分以及青錢柳多糖和苦瓜皂苷的保留率的影響，并通過L9(34)正交試驗進行優化。最佳工藝條件如下：體積分數10%的青錢柳多糖提取物儲備液，體積分數0.1%的苦瓜皂苷提取物儲備溶液，質量分數2.25%的木糖醇，質量分數0.2%的檸檬酸儲備溶液和質量分數0.02%甜菊糖。其制備的茶飲具有較高的穩定性，且色澤清晰、香氣宜人、酸甜可口，并具有青錢柳葉和苦瓜片的獨特風味。最后，將保健茶真空濃縮至原體積的1/10制成儲備液，并保存在4 ℃。

保健茶工作液的制備和涂布：保健茶儲備液(實驗組，Y)或滅菌純水(對照組，CK)與大腸桿菌OP50菌液按體積比為1∶9的比例混合，涂布于線蟲生長培養基上。

1.3 線蟲培養

野生型秀麗隱桿線蟲(the Bristol strain N2)，雌雄同體，北京市生命科學研究院惠贈；TK22 [mev-1(kn1)III]突變體線蟲,秀麗隱桿線蟲遺傳學中心；大腸桿菌OP50,周慶華教授(暨南大學生物醫學轉化研究所)惠贈。參考文獻[14]的方案，采用高氯酸鈉裂解法對線蟲進行同期化處理。

1.4 實驗方法

1.4.1 H2O2誘導的氧化應激試驗

H2O2誘導的氧化應激試驗操作參考文獻[11]的方案，挑取60只處理3 d的線蟲暴露于0.1%體積分數為30%的H2O2誘導的氧化應激壓力下。每隔30 min記錄線蟲生存、死亡數，直至線蟲全部死亡。

1.4.2 百草枯誘導的氧化應激試驗

百草枯誘導的氧化應激實驗操作參考文獻[11]的方案，挑取60只處理3 d的線蟲轉移至補充了10 mmol/L百草枯的藥物/對照線蟲生長培養基中，每隔24 h記錄生存、死亡數，直至線蟲全部死亡。

1.4.3 抗氧化酶或非酶活性測定

按照之前的方案[15],根據試劑盒提供的說明書進行測定,結果通過蛋白質濃度標準化。

1.4.4 關鍵抗逆/抗氧化基因表達分析

實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real time,polymerase chain reaction, qRT-PCR)的操作參考文獻[14]。引物如附表4所示，act-1為內參基因，使用2-ΔΔCt法對表達基因進行相對定量。

1.4.5 繁殖力測定

繁殖力通過產卵量、后代數和孵化率來綜合評價[13]。在產卵期每隔24 h將10條L4期幼蟲轉移至新平板中直至線蟲停止產卵，每組產卵的總數被認為是產卵量，孵出的后代數量是后代數，孵化率是后代數與產卵量的比值。

1.4.6 生長率測定

同期化的卵在20℃孵化48h后，對每個發育階段的線蟲數量進行計數[13]。

1.4.7 移動力測定

參考文獻[16]的方法記錄移動力。Ⅰ：線蟲不需經觸碰刺激可自發運動；Ⅱ：線蟲必須受到觸碰刺激才可運動；Ⅲ：線蟲在受到觸碰刺激之后只能擺動頭或尾。

1.5 數據處理

所有實驗均至少重復3次，結果以平均數±標準差表示，并通過SPSS 16.0軟件采用單因素方差分析法進行顯著性分析，P<0.05為顯著差異。其中，生存曲線使用GraphPad(Windows 5.00版)軟件進行log-rank檢驗分析顯著性。

2 結果與分析

2.1 對線蟲抗氧化應激性的影響

2.1.1 對野生型N2線蟲抗氧化應激性的影響

在H2O2急性氧化脅迫下，復合茶處理使線蟲生存曲線發生顯著右移(圖1-a)，線蟲的平均壽命提高了11%，中位壽命和最大壽命分別提高了15%和20%(表1)。同時，在百草枯誘導的氧化脅迫下也發現類似的保護作用，平均存活時間比未經處理的顯著增加了25%(圖1-b和表1)。

2.1.2 對突變體TK22線蟲抗氧化應激性的影響

為進一步測定復合茶對氧化損傷的防御作用，利用對氧化應激敏感的TK22 [mev-1 (kn1)III]突變體進行了H2O2誘導的氧化應激存活分析[17]。與對照組相比，經過復合茶培養的TK22突變體不僅生存曲線發生顯著右移(圖2)，而且平均壽命、中位壽命和最大壽命都得到顯著延長(表1)。綜上，復合茶具有提高線蟲的抗氧化應激的潛力。

a-H2O2誘導；b-百草枯誘導圖1 氧化脅迫下野生型N2的存活曲線Fig.1 Survival curve of wild type N2 under oxidative stress注：壽命曲線中*表示差異顯著(*為P< 0.05，**為P < 0.01和***為P < 0.001)(下同)

表1 不同處理條件下線蟲存活時間Table 1 Survival time of C.elegans under different treatments

(2)中位壽命是指存活率等于50%的時間。

(3)最大壽命是指存活率等于0%的時間。

(4)不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

圖2 H2O2誘導的氧化脅迫下突變體TK22的存活曲線Fig.2 Survival curve of mutant TK22 under H2O2-induced oxidative stress

2.2 對線蟲抗氧化防御體系的影響

2.2.1 對線蟲抗氧化酶防御體系的影響

作為機體抗氧化能力的重要組成部分，抗氧化防御系統也得到了進一步的研究[18]。由圖3可知，在抗氧化防御體系方面，復合茶處理組的線蟲在培養96 h后，其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的酶活力均得到顯著提高，分別增加了28%、106%和78%。

a-對線蟲SOD酶活力的影響; b-對線蟲CAT酶活力的影響; c-對線蟲GSH-Px酶活力的影響圖3 對線蟲抗氧化酶防御系統的影響Fig.3 Effect of health tea on the antioxidant enzyme defense system in C.elegans

2.2.1 對線蟲抗氧化非酶防御體系的影響

在抗氧化非酶系統方面，線蟲培養96 h后，復合茶處理組的GSH含量顯著增加33%(圖4-a)，氧化性谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)水平顯著降低了44%(圖4-b)。如圖4-c所示，作為氧化應激的動態指標——GSH/GSSG的比值從30.57顯著增加到72.83，與對照組相比顯著提高了1.38倍，這與GSH-Px的水平被復合茶顯著提高的結果相符，結果表明復合茶可能具有激活線蟲抗氧化防御系統的潛力。

a-GSH含量; b-GSSG含量; c-GSH/GSSG的比例圖4 對線蟲抗氧化非酶防御系統的影響Fig.4 Effect of health tea on the antioxidant nonenzyme defense system in C.elegans

2.3 對線蟲關鍵抗氧化和抗逆基因表達的影響

已知在線蟲中鑒定了許多調控氧化應激反應的遺傳因子和通路途徑[19]，因此通過qRT-PCR來定量一些對調節氧化應激反應起著關鍵作用的抗逆和抗氧化基因的表達水平。如圖5所示，與對照組相比，復合茶處理后超氧化物歧化酶基因(sod-3和sod-5)和過氧化氫酶基因(ctl-1和ctl-2)、熱激蛋白基因(hsp-16.1和hsp-16.2)的表達量顯著升高，因此復合茶增強線蟲抗氧化應激能力可能與促進抗氧化酶和抗逆基因的表達有關。

圖5 對線蟲關鍵抗氧化和抗逆基因表達的影響Fig.5 Effects of health tea on the expression of key antioxidant and stress resistant genes in C.elegans

2.4 對線蟲生理功能的影響

2.4.1 對線蟲繁殖的影響

如圖6所示，與對照組相比，線蟲的總產卵量、總后代數以及孵化率均沒有明顯的變化。復合茶處理的線蟲的第1天產卵量和后代數被顯著提高，而第3天產卵量和后代數被顯著抑制,原因可能是保健茶具有促進母體線蟲卵細胞的釋放的潛力，從而減少卵細胞在子宮內的滯留(圖6-a, 6-b)。考慮到總繁殖力沒有顯著變化，認為復合茶不會損害線蟲的繁殖力。

a-線蟲產卵量;b-線蟲后代數量;c-線蟲孵化率圖6 對線蟲繁殖力的影響Fig.6 Effects of health tea on the fecundity in C.elegans

2.4.2 對線蟲發育的影響

為了進一步探究復合茶是否會影響線蟲的生理功能，從發育的角度進行了初步評價。如圖7所示，同步化的卵經48 h孵化后，80%～84%的線蟲處于L4期，6%～8%達到L2/L3期，11～12%達到成蟲期。而經復合茶處理后，線蟲的發育情況并無明顯差異。

圖7 對線蟲發育的影響Fig.7 Effects of health tea on the development in C.elegans

2.4.3 對線蟲移動力的影響

線蟲的衰老伴隨著移動能力及對外界機械刺激反應的退化[20]。如圖8所示，復合茶能明顯提高線蟲移動能力，在后期(第11天)尤其顯著。

圖8 對線蟲移動力的影響Fig.8 Effects of health tea on the locomotivity in C.elegans

綜上，苦瓜青錢柳復合茶可以防止氧化應激的益處可能與其主要成分青錢柳多糖和苦瓜皂苷相關。據報道，苦瓜和青錢柳葉具有促進健康的潛力且是多功能的，具有多種生物活性，包括減肥、抗氧化、神經保護、抗糖尿病、抗癌、降壓、抗菌、抗高脂血癥和抗炎等體外和體內活性[21-22]。研究表明，苦瓜皂苷和青錢柳多糖分別是苦瓜和青錢柳葉中的主要活性成分[23-24]。青錢柳多糖也被證實可以保護氧化應激環境下的線蟲[11]，關于苦瓜皂苷對氧化應激下的線蟲提供的保護作用仍在研究中。因此，苦瓜青錢柳復合茶是一種富有前景的創新功能飲料。

3 結論

本研究利用秀麗隱桿線蟲模型探究一款自主研發的苦瓜青錢柳復合茶的抗氧化脅迫作用，結果表明，該復合茶具有優秀的抗氧化脅迫保護潛力且不影響線蟲的基本生理功能。進一步探究線蟲的抗氧化防御體系，發現其介導的抗氧化應激作用可能與上調抗氧化和抗逆相關基因的表達,從而激活機體抗氧化酶和非酶活性有關。總之，該復合茶具有用于預防氧化應激相關疾病的前景。同時，本研究也為今后以苦瓜皂苷和青錢柳多糖作為一種潛在的功能性配方開發更多具有健康益處的創新產品奠定了基礎。