永川毛霉型豆豉傳統發(fā)酵過程中微生物群落結構及動態(tài)演替規(guī)律

李薇，羅沈斌，邱澤瑞，賴登磊，王洪偉，索化夷*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市永川豆豉食品有限公司，重慶，402160)

豆豉是我國歷史悠久的傳統發(fā)酵調味食品，古稱“幽菽”，迄今已有兩千多年歷史。豆豉是以黃豆或黑豆為原料，經過微生物發(fā)酵制成，可分為米曲霉型、毛霉型、根霉型、脈孢菌型及細菌型五大類，其中尤以毛霉型豆豉最富特色[1]。永川豆豉是毛霉型豆豉的典型代表，不僅具有“疏松散籽、油亮發(fā)黑、味美化渣、清香回甜”的品質特點[2]，還富含大豆多肽、豆豉纖溶酶、類黑精及大豆異黃酮等功能性物質，對于延緩衰老、預防疾病、降血壓及抗氧化等方面具有積極作用[3-5]。

豆豉獨特的感官風味以及營養(yǎng)價值與參與發(fā)酵的微生物的群落結構密切相關[6]。然而傳統的分離培養(yǎng)鑒定法僅能獲得少數優(yōu)勢菌群，不能真實反映發(fā)酵樣品中微生物的區(qū)系變化規(guī)律，存在較大局限性。高通量測序技術，尤其是16S rRNA多樣性測序及宏基因組測序技術的快速發(fā)展與應用為復雜發(fā)酵食品中微生物區(qū)系的研究提供了有效解決方案[7-8]。目前，已有研究者利用高通量測序技術對江西特色發(fā)酵豆豉微生物的群落特征[9]、湖南瀏陽豆豉不同工藝階段的微生物多樣性[10]、湖北當陽[11]及云南地區(qū)豆豉[12]中細菌群類進行評價，為挖掘豆豉中微生物資源，提高豆豉產品品質與食用安全性提供了理論支撐。然而，利用高通量測序技術再現毛霉型豆豉中菌群環(huán)境的研究還未見報道。

永川毛霉型豆豉采用傳統自然制曲的開放式發(fā)酵方式，且后發(fā)酵時間長達1年，這使得其發(fā)酵過程中有更為復雜的微生物參與作用。曾濤等[13]曾采用聚合酶鏈反應變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術研究了永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中細菌群落的變化，但該方法存在通量低、PCR擴增的偏好性而精確度不高等局限，只能檢測出發(fā)酵微生物的部分種類，無法更深入地研究。因此，本研究采用高通量測序技術探索制曲階段及后發(fā)酵階段永川毛霉型豆豉中菌落的動態(tài)變化，揭示發(fā)酵過程中的核心微生物，從而為探尋豆豉中微生物群落與品質、功能性組分之間的關系，創(chuàng)新豆豉的生產工藝，開發(fā)毛霉型豆豉復合發(fā)酵劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

永川毛霉型豆豉，重慶市永川豆豉食品有限公司；無水乙醇(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；土壤基因組提取試劑盒，Omega公司；PCR反應系列試劑，北京天根生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

手提式不銹鋼滅菌鍋(YX280A)，上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平(FA2004)，上海舜宇恒平儀器有限公司；單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-2F)，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；臺式高速冷凍離心機(5810R)，Eppendorf公司。

1.3 豆豉采集

永川毛霉型豆豉：制作工藝包括選料、浸泡[豆∶水= 1∶20(g∶mL)，20～25 ℃，2 h]、蒸煮(121 ℃，1 h)、冷卻、自然制曲(將攤料以“中間薄，四周厚”的方式入室攤放在簸箕或曬席上，按質量分數為1%添加種曲，10～20 d)、下架、拌料(食鹽、醪糟、白酒的質量分數分別為18%、3%和3%)、常溫后熟發(fā)酵1年。本研究的樣品分為制曲階段的曲料及不同后發(fā)酵階段的豆豉，分別在制曲第1、3、6和8天于重慶市永川豆豉食品有限公司曲室中取樣(編號：f1、f3、f6和f8)，并采集制曲結束、經拌料后的豆豉曲胚在實驗室進行后熟發(fā)酵，分別于發(fā)酵第25、53、75、165和225天取樣(編號：d5、d6、d7、d8和d9)，每個階段采集3個樣品。取樣后存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 永川毛霉型豆豉發(fā)酵過程中宏基因組DNA提取及PCR擴增

稱取5～6 g永川毛霉型豆豉樣品，放入研缽中，加入占研缽體積2/3的液氮，立即在液氮中充分研磨豆豉，直至細粉狀(一般加入液氮8～9次)，稱取50～100 mg豆豉樣品，按照土壤基因組提取試劑盒說明書進行后續(xù)操作，得到豆豉宏基因組DNA，保存于-20 ℃冰箱里。

以338F-806R作為引物對細菌16S rRNA V3～V4區(qū)序列進行擴增，以ITS1F-2043R為引物對真菌ITS區(qū)域進行擴增。將PCR擴增產物切膠回收，根據PCR產物檢測方法進行檢測定量。將處理好的PCR擴增產物送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina Miseq測序。

1.5 數據與圖譜分析

高通量測序數據采用美吉云計算平臺分析，根據97%相似性采用UCLUST軟件進行OTU聚類。

2 結果與分析

2.1 真菌群落結構分析

永川豆豉不同發(fā)酵階段中真菌在門水平的高通量相對豐度分布如圖1-a所示，子囊菌門(Ascomycota)和接合菌門(Zygomycota)是優(yōu)勢真菌門(相對豐度>1%)，平均相對豐度分別為84.52%及14.96%。制曲第1天(f1)擔子菌門(Basidiomycota)也屬于優(yōu)勢類群，但在制曲第2天(f2)其相對豐度便下降至低于1%。接合菌門在制曲階段相對豐度在10.03%～54.00%，在后發(fā)酵初期(d5)下降至0.07%，后隨著發(fā)酵的進行相對豐度緩步上升。作為突出優(yōu)勢門的子囊菌門在制曲階段相對豐度先降低后增加，在后發(fā)酵階段相對豐度維持在98%以上。

a-門水平；b-屬水平圖1 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段真菌在門水平和屬水平的高通量相對豐度Fig.1 Relative abundance of fungi at phylum level and genus level in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi注：Others為平均相對豐度<1%的門或屬

真菌在屬水平的高通量相對豐度分布如圖1-b所示，共測得17屬真菌。制曲第1天(f1)真菌種類豐富，隨著制曲發(fā)酵進行到第6天(f6)，真菌種類多樣性逐漸降低，在制曲第8天(f8)又迅速增多。制曲階段主要由毛霉屬(Mucor)占主導作用，尤其在制曲第3天(f3)和第6天(f6)，其相對豐度分別達到53.98%和50.87%。而在制曲第8天，鐮孢霉屬(Fusarium)(12.78%)和赤霉屬(Gibberella)(50.35%)的相對豐度迅速增加。進入后發(fā)酵階段后真菌多樣性快速降低。曲霉屬(Aspergillus)在后發(fā)酵階段成為優(yōu)勢菌群(后發(fā)酵階段平均相對豐度為63.79%)，而青霉屬(Penicillium)在整個發(fā)酵過程都具有較大相對豐度(12.19%～64.17%)，與毛霉屬、赤霉屬以及曲霉屬等霉菌形成競爭關系，搶占其他真菌的生存空間。此外，整個發(fā)酵過程中還檢測到德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)和假絲酵母屬(Candida)等酵母菌屬。從后發(fā)酵53 d(d6)開始，部分耐鹽耐高滲透壓的真菌適應環(huán)境后開始緩慢生長，群落多樣性增加，漸趨穩(wěn)定。

2.2 細菌群落結構分析

細菌在門水平的高通量相對豐度分布如圖2-a所示，厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門 (Proteobacteria)是優(yōu)勢細菌門(相對豐度> 1%)，平均相對豐度分別為48.76%和47.37%。厚壁菌門在制曲前6 d相對豐度>70%，隨著制曲階段進入尾聲(f8)，其相對豐度降低至21.42%。進入后發(fā)酵階段后，多數細菌群落多樣性降低，但厚壁菌門相對豐度卻迅速增至53.23%。變形菌門在后發(fā)酵階段的平均相對豐度為65.38%，為突出優(yōu)勢門，與厚壁菌門形成競爭關系。樣本f8中細菌群落結構最豐富，藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度在f8中快速增至11.36%、6.95%和1.59%，但進入后發(fā)酵期后迅速降低。

由細菌在屬水平的高通量相對豐度分布(圖2-b)可知，永川豆豉在不同發(fā)酵階段細菌的種類和相對豐度有較大差異，且相比真菌而言，細菌的種類更加豐富，與通過PCR-DGGE技術檢測得到的結果基本一致[13]。細菌種類隨著制曲的進行逐漸豐富，在f8中達到最大。檢測到的25屬主要的細菌大多集中在f8。制曲階段魏斯氏菌屬(Weissella)、明串珠菌屬(Leuconostoc)及乳酸桿菌屬(Lactobacillus)均為優(yōu)勢菌屬，然而進入后發(fā)酵階段后，上述3種菌屬幾乎停止生長。芽孢桿菌屬(Bacillus)、代爾夫特菌屬(Delftia)以及根瘤菌屬(Rhizobium)為后發(fā)酵階段相對豐度較大的細菌屬。值得注意的是，芽孢桿菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)以及乳球菌屬(Lactococcus)在競爭最激烈的制曲后期及環(huán)境發(fā)生變化的后發(fā)酵初期相對豐度還出現增長趨勢，與趙文鵬等[14]研究結果一致。

2.3 真菌聚類分析及主成分分析

非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)假設在進化過程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的變異率，即存在著一個分子鐘，通過樹枝的長短可以觀察樣本間的進化距離[15]，直觀顯示不同豆豉樣本中微生物進化上的相似性及差異性[16]。

真菌區(qū)系UPGMA聚類分析如圖3-a所示，永川毛霉型豆豉制曲階段和后發(fā)酵階段真菌群落結構遺傳距離較遠，而處在同一發(fā)酵階段的遺傳距離相對較近。相鄰時間樣本的真菌群落結構差異性不大，但制曲階段(或后發(fā)酵階段)前期和后期有明顯差異，說明真菌群落結構的變化是一個逐步演替的過程。真菌區(qū)系主成分分析(圖3-b)中，PC1和PC2兩軸的累積方差解釋率達到了89.27%，能夠較好區(qū)分不同發(fā)酵階段樣本中真菌群落結構的差異性。制曲階段樣本點較為分散，而后發(fā)酵階段樣本點則相對集中，表明制曲階段真菌群落結構的差異較后發(fā)酵階段更大。結合群落結構分析結果來看，f3與f6真菌區(qū)系較為接近，與優(yōu)勢菌屬毛霉屬和青霉屬的相對豐度差異較小有關；與f3和f6相比，f1中毛霉屬相對豐度較低，德巴利氏酵母屬、曲霉屬和單端孢霉屬(Trichothecium)等菌屬的相對豐度較高，而f8中赤霉屬和鐮孢霉屬取代了青霉屬和毛霉屬的絕對優(yōu)勢地位，從而造成制曲階段真菌群落結構差異。

2.4 細菌聚類分析及主成分分析

由細菌區(qū)系UPGMA聚類分析(圖4-a)可知，不同發(fā)酵階段細菌區(qū)系結構存在較大差異，并且制曲階段樣本間的遺傳距離遠大于后發(fā)酵階段，說明制曲階段細菌群落演替更為激烈。圖4-b為細菌群落結構主成分分析圖。PC1與PC2能夠分析整個發(fā)酵樣品80.23%的OTU，具有較高解釋率。制曲階段樣本點非常分散，而后發(fā)酵階段樣本點則相對集中，與聚類分析結果相佐證。參照群落結構分析結果，引起制曲階段細菌區(qū)系發(fā)生較大變化的菌屬有魏斯氏菌屬、明串珠菌屬、乳酸桿菌屬、庫特氏菌屬(Kurthia)及葡萄球菌屬，在制曲階段呈現顯著的或增或減的趨勢，并且隨著制曲發(fā)酵的進行，細菌多樣性增加，其中短波單胞菌屬(Brevundimonas)和1種未分類的鞘脂桿菌科菌屬(Sphingobacteriaceae)分別在f6和f8開始出現。后發(fā)酵階段代爾夫特菌屬、根瘤菌屬以及芽孢桿菌屬的相對豐度在d5與d9、d6與d7中相似，而在d8中處于上述2組的中等水平，并且d8中乳球菌屬的相對豐度達到整個發(fā)酵過程中的最大值，因此d8與其他后發(fā)酵階段樣本存在較大差異。

a-聚類分析；b-主成分分析圖4 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段細菌微生物區(qū)系UPGMA聚類分析和主成分分析Fig.4 UPGMA cluster analysis and principal component analysis of bacterial microflora in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi

2.5 真菌分子進化分析

微生物系統發(fā)生進化樹作為1種分子生物學分析工具，可通過樹枝狀結構表示生物間的發(fā)育進化關系，樹枝長短則對應進化距離[17]。通常采用某一分類水平上序列間堿基的差異構建進化樹[18]，本研究選擇在屬分類水平上進行構建。圖5為永川豆豉發(fā)酵過程中真菌的發(fā)育進化樹分析圖。共檢測出57屬真菌微生物，其中根霉屬(Rhizopus)、曲霉屬、毛霉屬、青霉屬和接合酵母屬(Engagementyeast)等17屬不同真菌的相對豐度較大，且親緣關系較近。毛霉屬發(fā)育進化最簡單，在系統發(fā)育樹中獨占一枝，是永川豆豉整個發(fā)酵階段，尤其是制曲階段的核心菌群。曲霉屬和青霉屬的親緣性接近，兩者進化程度基本一致。節(jié)擔菌屬(Wallemia)伴隨著毛霉屬的進化發(fā)育進行生長，但在整個發(fā)酵過程中幾乎檢測不到節(jié)擔菌屬的存在，可能與真菌及其代謝產物的抑制有關。

圖5 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段真菌屬水平系統發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of fungi at genus level in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi

2.6 細菌分子進化分析

永川毛霉型豆豉在發(fā)酵過程中各個發(fā)酵階段的細菌微生物十分豐富(圖6)，達到105個屬別，相對豐度>5%的達到25屬，包括魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬、棒狀桿菌屬、庫特氏菌屬和克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)等。其中，魏斯氏菌屬和明串珠菌屬的親緣性接近，鏈球菌屬(Steptococcus)和乳球菌屬的親緣性接近，且其他分支上的主要細菌屬別的差異性亦較小，進化程度相似。因此，對這25屬主要細菌進行分析，可真實再現永川豆豉在發(fā)酵過程中細菌進化的親緣性程度。

圖6 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段細菌屬水平系統發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of bacteria at genus level in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi

2.7 真菌線性判別分析

圖7為永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段真菌進化分枝圖。由圖7可知，在永川毛霉型豆豉制曲階段和后發(fā)酵時期具有重要性的真菌有較大差別。根霉屬、曲霉屬、毛霉屬、單端孢霉屬、節(jié)擔菌屬等是在制曲期間起主要作用的真菌。在后發(fā)酵期間，子囊菌門(Ascomycota)、散囊菌目(Eurotiales)、威克漢姆酵母屬、毛霉屬等真菌起主導作用。由此可見，在后發(fā)酵階段產生重要作用的真菌較制曲階段少，主要原因在于拌料工藝形成的后發(fā)酵環(huán)境不適于大多數真菌代謝生長，使得以毛霉屬為主的少部分在后發(fā)酵階段起較大作用的真菌相對豐度較低。但制曲過程所產生的豐富酶類對后發(fā)酵產生關鍵的作用。

圖7 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段真菌進化分枝圖Fig.7 Branching chart of fungi evolution in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi注：紅色區(qū)域代表后發(fā)酵階段，綠色區(qū)域代表制曲階段；樹枝中紅色節(jié)點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節(jié)點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，黃色節(jié)點表示的是在2組中均沒有起到重要作用的微生物類群(下同)

2.8 細菌線性判別分析

圖8為永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段細菌進化分枝圖。由圖8可知，后發(fā)酵階段起重要作用的細菌較制曲階段多。在制曲階段起重要作用的細菌主要有棒狀桿菌屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬和鞘脂菌屬(Sphingobium)等。到后發(fā)酵期間，芽孢桿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、庫特氏菌屬、葡萄球菌屬和乳球菌屬等主要細菌對豆豉品質形成起到的作用較大。也有部分細菌如芽孢桿菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬等在制曲階段的作用較大，在后發(fā)酵階段也具有重要性。

圖8 永川毛霉型豆豉不同發(fā)酵階段細菌進化分枝圖Fig.8 Branching chart of bacteria evolution in different fermentation stages of Mucor-type Yongchuan Douchi

3 討論

本研究采用高通量測序技術對制曲階段及后發(fā)酵階段永川毛霉型豆豉中菌落的動態(tài)變化以及在不同階段占主導作用的核心微生物進行研究，共檢測到17屬主要真菌和25屬主要細菌。發(fā)酵過程中微生物的多樣性主要受發(fā)酵環(huán)境的溫度、濕度和水分活度等因素影響，因此,制曲階段及后發(fā)酵時期菌群群落結構及主導微生物均有較大差異。永川豆豉采用開放式制曲，微生物在制曲第6天開始進入對數期，到制曲第8天達到最大值[19]。進入后發(fā)酵階段后，由于拌入食鹽、醪糟和白酒等輔料，形成高鹽、高滲透壓和低水分活度環(huán)境，并在密閉條件下進一步的發(fā)酵，導致微生物多樣性迅速降低。較真菌而言，細菌的生長速率快、代謝較短，因此，在整個發(fā)酵階段細菌的多樣性高于真菌。

制曲在曲房中進行，相對濕度和溫度等條件非常適合細菌生長，因此，制曲階段細菌多樣性成倍增長，在制曲第8天達到最大。進入后發(fā)酵階段后，高滲、密閉的環(huán)境不適宜大部分細菌生長[20]，另外，明串珠菌屬、乳酸桿菌屬及魏斯氏菌屬還會由于乳酸菌自身代謝產生的酸性環(huán)境而受到抑制[21]。然而，芽孢桿菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬和葡萄球菌屬在后發(fā)酵階段仍具有相對穩(wěn)定的豐度，是由于它們均隸屬于厚壁菌門，對發(fā)酵環(huán)境的改變具有較高抗逆性[22]。這也使得厚壁菌門在其他豆豉[23-24]以及泡菜[25]中成為優(yōu)勢菌門。真菌多樣性在制曲階段呈現先降低后迅速增加的趨勢，而在后發(fā)酵初期相對豐度>1%的也僅有隸屬于子囊菌門的曲霉屬和青霉屬，說明以霉菌為主的真菌對環(huán)境的改變較為敏感。隨著發(fā)酵的進行，一些厭氧耐鹽的霉菌逐漸適應生長環(huán)境，后發(fā)酵階段真菌多樣性開始緩步增加。在這一階段發(fā)揮主導作用的有子囊菌門、散囊菌目、威克漢姆酵母和毛霉屬等真菌。也就是說，盡管相對豐度較低，但不影響以毛霉屬為首的這些真菌在后發(fā)酵階段發(fā)揮重要作用。

制曲階段，毛霉屬和根霉屬共同作用，能夠產生多種蛋白酶、脂肪酶以及糖化酶，這些酶類存在于整個發(fā)酵過程，將大豆蛋白、脂肪及淀粉分解，形成毛霉型豆豉獨特的口感與風味，賦予其多種營養(yǎng)和生理功能；芽孢桿菌屬和包括乳桿菌屬、乳酸球菌屬在內的乳酸菌可以適應整個發(fā)酵環(huán)境，產生蛋白酶、淀粉酶等多種酶類，對永川豆豉在后發(fā)酵階段風味的形成發(fā)揮不可替代的作用[26-27]；乳酸菌還能提高豆豉的總酸度，降低發(fā)酵環(huán)境pH，進一步抑制其他雜菌的生長；另外，假絲酵母屬、德巴利氏酵母屬等酵母可通過分泌蛋白酶、脂肪酶等多種酶類進一步提升豆豉的風味品質[28]；根霉屬還能分泌β-葡萄糖苷酶以及多種糖化酶，不僅能促進豆豉中產生具備生物活性的苷元型大豆異黃酮，使其具備更高的營養(yǎng)價值，還能促進豆豉中多糖糖化形成多種還原糖，為美拉德反應提供原料，進而促進類黑精的生成和積累，使豆豉具有黝黑的色澤。因此，毛霉型豆豉近一年的后發(fā)酵是風味品質形成的關鍵所在。

4 結論

本研究通過高通量測序對永川毛霉型豆豉制曲及后發(fā)酵階菌群結構進行較為全面地研究。整個發(fā)酵過程中細菌多樣性高于真菌，制曲階段微生物多樣性較后發(fā)酵階段更為豐富，但后發(fā)酵階段是永川毛霉型豆豉風味及品質形成的關鍵時期。在制曲階段發(fā)揮主導作用的有根霉屬、曲霉屬和毛霉屬等真菌，以及棒狀桿菌屬、擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、明串珠菌屬等細菌。后發(fā)酵階段微生物群落結構發(fā)生較大改變，但芽孢桿菌屬、乳球菌屬、根瘤菌屬和葡萄球菌屬等細菌仍具有較為穩(wěn)定的相對豐度，而毛霉屬盡管相對豐度較低，但其所產生的酶類仍在后發(fā)酵階段中發(fā)揮著重要作用。