泡菜水品質和細菌類群的關聯性

郭壯，吳璞穎，趙楠，張振東，侯強川*

1(湖北文理學院 食品科學技術學院，湖北 襄陽，441053)2(四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都，610066)

安康地區的酸菜又稱“漿水酸菜”，以當地特有紅皮蘿卜(RedRaphanussativus)纓為主料，輔以小蔥或韭菜發酵而成。發酵不僅有效延長了蔬菜的食用期，更賦予了泡菜與所使用原料完全不同的獨特風味[1]，期間微生物的代謝活動是泡菜風味品質形成的最為重要因素[2]。近年來，研究人員系統解析了四川[3]、山西[4]和東北地區[5]泡菜的微生物類群，證實乳酸菌是泡菜發酵過程中的優勢菌。研究顯示，地理距離越遠、環境差異越大，不同地區發酵食品的微生物類群構成差異亦越大[6]。特殊的地理環境和原料是否賦予了安康地區泡菜較為獨特的微生物類群，值得進一步研究。

作為仿生學技術，電子舌和電子鼻對一類味覺或嗅覺化合物具有整體選擇性，體現了各化合物之間相互作用的特性，在食品品質評價方面具有一定的技術優勢，得到了廣泛應用[7-8]。研究人員對泡菜中的微生物類群進行解析的根本目的之一在于探討泡菜風味形成的機制，進而尋求提升泡菜品質的途徑[9]。目前針對乳酸菌對泡菜風味影響的研究較多，但更多的局限于乳酸菌單菌種發酵，而對于微生物類群或多株菌相互作用對泡菜品質影響的研究報道尚少[10]。較之純培養技術和指紋圖譜技術，以MiSeq為代表的第二代高通量測序技術的出現，實現了對發酵食品微生物類群更為全面和系統地解析[11]，使探討微生物類群與泡菜品質的關聯性研究成為可能。

本研究首先使用電子舌和電子鼻技術對安康地區泡菜水品質進行評價，繼而采用MiSeq測序技術對泡菜水中微生物類群進行解析，最后基于Procrustes分析對泡菜水品質和細菌多樣性的關聯性進行了研究，以期為我國特色泡菜制品微生物類群的揭示和產品品質特征形成原因，提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FastPfu Fly DNA Polymerase、dNTPs Mix、FastPfu Buffer，北京全式金生物技術有限公司；參比溶液、極性溶液、味覺標準溶液，日本INSENT公司；NaCl，國藥集團化學試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；MiSeq高通量測序配套試劑，美國Illumina公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SA 402B電子舌，日本INSENT公司；PEN3電子鼻，德國AIRSENSE公司；TGL-16M 冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統，美國ProteinSimple公司；Veriti FAST梯度PCR儀，美國ABI公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺，美國Illumina公司；R920型機架式服務器，美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于2019年12月上旬從陜西省安康市鎮坪縣(E109°52′，N31°88′)和嵐皋縣(E108°9′，32°32′)的農戶家中采集泡菜水14 份，編號為AK1～AK14，泡菜制作時間為2019年10月下旬—11月中旬，均使用老鹵作為“引子”，原料均為紅皮蘿卜纓，少部分樣品添加了韭菜和蔥等輔料用于提味，泡菜水均為鮮亮的酒紅色。樣品采集時，首先使用長柄湯勺在泡菜壇中攪拌2 min，繼而從上層舀取約200 mL泡菜水于500 mL樣品瓶中。樣品瓶置于含有冰袋的采樣箱中低溫運回實驗室，途中每隔6 h左右擰開瓶蓋排放樣品產生的氣體。

1.3.2 基于電子舌技術泡菜水滋味品質的評價

量取50 mL泡菜水和50 mL蒸餾水混合均勻后于8 000 r/min離心10 min，取上清液于電子舌測試杯中，參照文獻[12]進行分析。

1.3.3 基于電子鼻技術泡菜水風味品質的評價

量取15 mL泡菜水于8 000 r/min離心10 min，取上清液于配套樣品瓶中，樣品瓶置于60 ℃的水浴鍋中保溫30 min，并于室溫平衡10 min后上機測試。參照倪慧等[13]對泡蘿卜水的測試參數進行分析，每份樣本平行測試3 次，選取59、60和61 s時的響應值為測試值進行后續研究。

1.3.4 微生物宏基因組DNA提取和擴增

吸取20 mL泡菜水，于400 r/min離心10 min，取上清液，于8 000 r/min離心10 min取菌泥，使用基因組提取試劑盒進行DNA提取，參照折米娜等[14]方法對細菌16S rRNA V3～V4區進行擴增，擴增后的產物送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。

1.3.5 生物信息學分析

使用QIIME(v1.70)平臺對質控后的測序數據進行分類操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)劃分、分類學地位注釋、α多樣性分析和β多樣性分析[15]，主要流程參照YANG等[16]對干酪中細菌多樣性的研究。所有測序數據均已提交至MG-RAST數據庫，登錄號為mgp93 238。

1.3.6 多元統計學分析

采用皮爾森相關性分析對平均相對含量>1.0%的細菌屬和品質指標之間的相關性進行研究；選取相關系數>0.4或<-0.4，且校正后P<0.05的品質指標，采用Cytoscape軟件(v3.5.1)進行相關性網絡圖繪制；使用Procrustes分析對泡菜水菌群和品質進行共變化分析。其他繪圖使用R軟件和Origin 2019b軟件完成。

2 結果與分析

2.1 泡菜水滋味和風味品質的評價

泡菜水各滋味指標相對強度的箱型圖如圖1所示。

圖1 泡菜水滋味指標相對強度值的箱形圖(n=14)Fig.1 Relative intensity of taste indexes in Paocai brine display by box chart注:后味A，澀的回味；后味B，苦的回味;豐度，鮮的回味

由圖1可知，泡菜水的滋味品質之間存在較大的差異，酸味、澀味、咸味、鮮味、后味A和豐度的極差值均>1，其中酸味的組內差異最大。基于電子鼻技術，泡菜水風味指標強度表如表1所示。

表1 泡菜水風味指標強度表(n=14)Table 1 Relative intensity of flavor indexes in Paocai water

由表1可知，所有泡菜水的各風味指標之間均存在著較大的差異，響應值差異較大的傳感器分別為W1C、W5S和W2S，差異系數分別為40.55%、40.47%和35.65%。由此說明，不同樣品揮發性風味物質的差異主要在芳香類物質、氮氧化物和乙醇上。

2.2 泡菜水物種構成及多樣性分析

進一步采用高通量測序技術對泡菜水中細菌構成和功能進行解析，發現泡菜水中細菌隸屬于23 個門，其中優勢細菌門(平均相對含量>1.0%)相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 基于門水平泡菜水細菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of bacterial structure in paocai brine at the phylum level

由圖2可知，Firmicutes(硬壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Actinobacteria(放線菌門)為3 個優勢細菌門，其平均相對含量分別為90.19%、7.95%和1.01%，大部分泡菜水中變形菌門和放線菌門的相對含量極低，僅AK11和AK14中存在較多的變形菌門。泡菜水中優勢細菌屬(相對含量>1.0%)相對含量比較分析如圖3所示。

圖3 基于屬水平泡菜水細菌類群的比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial structure in Paocai brine at the genus level

由圖3可知，泡菜水中共發現284 個細菌屬，Pediococcus(片球菌屬)、Lactobacillus(乳桿菌屬)和Pseudomonas(假單胞菌屬)為優勢菌屬，平均相對含量分別為55.53%、29.83%和4.27%。AK1、AK2、AK7、AK8、AK9、AK12和AK13均以Pediococcus為主；AK3、AK4、和AK10均以Lactobacillus為主；AK5、AK6和AK11以Pediococcus和Lactobacillus為主，其比例接近1∶1；而AK14則以Pediococcus和Pediococcus為主，其比例亦接近1∶1。由此可見，雖然不同樣品間優勢菌群的類群相同，但其含量存在明顯差異。

2.3 菌群與泡菜水品質關聯性分析

為了探究菌群對于泡菜水品質的影響，本研究采用Procrustes分析方法，對泡菜水中菌群和品質之間的共變化趨勢進行了分析，結果如圖4所示。

圖4 基于Procrustes分析菌群結構和品質的共變化趨勢Fig.4 Covariant trend of microbial structure and quality of Paocai brine based on procrustes analysis

由圖4可知，基于菌群結構和品質結構的同一泡菜水樣品在空間排布上呈現一定的相似性，經Procrustes轉換和顯著性檢驗發現其相關性非常顯著(P=0.001)。由此說明，泡菜水中的菌群群系對泡菜水的品質形成具有顯著的影響。為進一步探究菌群對泡菜水品質的影響，本研究對優勢菌屬與泡菜水品質之間的相關性進行了計算，結果如圖5所示。

圖5 泡菜水優勢細菌屬和品質指標相關性的網絡圖Fig.5 Network diagram of the correlations among dominant bacterial genera and sensory indicators in Paocai brine注：實線表示正相關，虛線表示負相關；線的粗細表述相關性的大小

由圖5可知，乳桿菌屬與3 個對芳香型化合物敏感的傳感器響應值均呈顯著正相關(P<0.05)，而與對有機硫化物、氮氧化物和乙醇等化合物敏感的傳感器響應值呈顯著負相關(P<0.05)，片球菌屬則呈現相反趨勢；假單胞菌屬僅與酸味指標呈顯著負相關(P<0.05)。由此可見，乳酸桿菌的群系構成對泡菜品質的形成具有重要作用。

3 結論與討論

本研究采用MiSeq高通量測序技術發現Firmicutes為安康地區泡菜水中的優勢細菌門，與以往研究結論相同[17]。亦發現Pediococcus、Lactobacillus和Pseudomonas為優勢細菌屬，累計平均相對含量高達近90%。前期針對不同地區微生物優勢群系研究的報道與本研究存在一定的差異，JEONG等[18]和KIM等[19]研究表明，Lactobacillus、Weissella(明串珠菌屬)和Leuconostoc(腸球菌屬)為韓國泡菜(Kimchi)中的優勢菌屬；CAO等[20]研究表明Lactobacillus和Pediococcus在四川地區泡菜中占主導地位，ZHAO等[21]對四川地區泡菜研究表明除Lactobacillus和Pediococcus外，還存在Leuconotoc和Lactococcus(乳球菌屬)；李欣蔚等[22]對東北地區泡菜研究表明Lactobacillus、Pediococcus和Pseudomonas為其優勢菌屬，同時存在Wohlfahrtiimonas(污蠅解殼桿菌屬)細菌。造成差異的原因可能在于泡菜中的微生物群系受制作地環境、制作工藝、原料、溫度、鹽濃度和酸度等諸多因素的影響[23]。

各地在制作泡菜時均偏愛使用老鹵作為“引子”，長時間循環使用的老鹵可以賦予泡菜更好的感官品質，原因在于老鹵中含有較高含量的乳酸菌菌群，循環使用時間越長鹵水中細菌多樣性越低，但耐酸的Lactobacillus含量反而越高[20]。本研究采用Procrustes分析發現泡菜水中的菌群群系與泡菜水品質具有共變化趨勢，同時相關性分析結果表明,Lactobacillus與泡菜水中芳香性揮發物質含量呈正相關。由此可見，Lactobacillus對安康地區泡菜水品質的形成和提升具有積極的作用。

本研究推斷安康地區泡菜水中可能存在較為獨特的細菌乃至乳酸菌類群，在對安康地區泡菜水中乳酸菌資源進行收集、鑒定和保藏的基礎上，采用全基因組測序對具有優良發酵特性乳酸菌菌株的功能特征和發酵特性進行解析[24]，無論是對泡菜微生物群系和遺傳多樣性等理論研究，還是對泡菜品質的提升均具有積極意義。在后續研究中從四川省、重慶市及東北地區采集更多的泡菜水樣品，使用MiSeq測序技術實現多地區來源樣品細菌類群的全面、平行分析，進而實現不同產地樣品中核心細菌類群的甄別，對安康地區泡菜水中可能存在較為獨特的細菌乃至乳酸菌類群這一推論的驗證具有積極意義。不可否認，由于MiSeq測序技術僅針對細菌16S rRNA的某一個或幾個區域進行測序，故在解析微生物群落結構時為保證結果的可靠性，一般僅在分類學地位“屬水平”上展開分析討論，且更關注相對含量>1.0%的微生物類群[25]，加之納入本研究的樣品僅采集自安康地區，因而使得本研究存在一定的局限性。后續研究中采用在測序讀長方面具有天然優勢的PacBio SMRT測序技術或使用宏基因組學測序手段在分類學地位“種水平”進一步對泡菜水中細菌類群進行解析亦極為必要。