熱應(yīng)激致大鼠睪丸中熱休克蛋白A2及幾種熱休克轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化研究*

李 銳 陳雪丹 張慶華**

1. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（重慶400042）；2. 陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室（重慶400038）

前 言

男性不育已成為一個(gè)全球性的人口健康問(wèn)題，而精子質(zhì)量下降是造成男性不育的主要原因。 Levine 等[1]研究發(fā)現(xiàn)， 僅1973 年至2011 年人類精子數(shù)量就下降了52.4%。 睪丸是精子發(fā)育的重要場(chǎng)所，影響其正常結(jié)構(gòu)和功能的外界因素眾多，大體上可分為物理因素、化學(xué)因素以及生物因素。 其中，物理因素中的高溫對(duì)精子的損傷機(jī)制為研究熱點(diǎn)之一。

熱休克反應(yīng)（Heat-Shock Response,HSR）是生物機(jī)體在熱應(yīng)激（或其他應(yīng)激）狀態(tài)下所表現(xiàn)的一種以基因表達(dá)變化為特征的防御適應(yīng)性反應(yīng)。 對(duì)于大多數(shù)體細(xì)胞，這種反應(yīng)旨在保護(hù)細(xì)胞免受損傷[2]，但對(duì)于睪丸內(nèi)的生殖細(xì)胞（主要是減數(shù)分裂細(xì)胞和減數(shù)分裂后的細(xì)胞），熱應(yīng)激并未促發(fā)這種保護(hù)性反應(yīng)。 與此相反，受影響的生殖細(xì)胞通過(guò)凋亡途徑被清除了[3]。 現(xiàn)有研究表明，熱應(yīng)激可導(dǎo)致精子濃度降低，精子活性及運(yùn)動(dòng)能力受損[4]。 此外，熱應(yīng)激下精子頭部的某些性狀也可發(fā)生改變，并直接影響受精[5]。 但熱應(yīng)激導(dǎo)致精子發(fā)育功能障礙的內(nèi)在機(jī)制還知之甚少。 既往研究提示[6-8]，熱應(yīng)激可能通過(guò)誘導(dǎo)普列克底物蛋白同源樣結(jié)構(gòu)域家族A 成員1 蛋 白（pleckstrin homology-like domain family A member 1,PHLDA1）、 佛波醇-12- 肉豆蔻酸-13- 乙酸誘 導(dǎo) 蛋 白 1（Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced Protein 1, PMAIP1）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）等的表達(dá)上調(diào)，最終引發(fā)生精細(xì)胞凋亡。 這可能在一定程度上說(shuō)明熱應(yīng)激致精子數(shù)量減少的本質(zhì)原因， 卻很難解釋由熱應(yīng)激所導(dǎo)致的精子活性及運(yùn)動(dòng)能力損傷。 因此，一個(gè)可能的推測(cè)是，多種因素聯(lián)合作用共同介導(dǎo)了熱應(yīng)激下精子損傷的發(fā)生。 現(xiàn)已知一系列熱休克蛋白（heat shock protein , HSP ） 及 熱休 克 轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factor,HSF）參與了精子發(fā)育過(guò)程。尤其是熱休克蛋白A2（heat shock protein A2,HSPA2），其為一種在睪丸中組成型高表達(dá)的HSP， 大量研究證實(shí)其對(duì)精子發(fā)生及其成熟都是必不可少的， 而HSF 在精子發(fā)育中的作用也見(jiàn)諸報(bào)道[9-10]。 HSF 又是調(diào)節(jié)HSP 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)[10]，人基因組共編碼6 種HSF，即HSF1、HSF2、HSF4、HSF5、HSFX 和HSFY，它們?cè)诓溉閯?dòng)物精子發(fā)生的過(guò)程中均有表達(dá)，但其表達(dá)譜呈現(xiàn)較大差異，其中HSF5 和HSFY 僅在睪丸中表達(dá)，HSF2 為全身性表達(dá)，但在睪丸中表達(dá)量較高，HSF4 可見(jiàn)于多種組織，但主要在晶狀體中表達(dá)，而HSF1 為全身性表達(dá)，無(wú)明顯組織特異性，是介導(dǎo)熱休克反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。

本研究試圖通過(guò)構(gòu)建大鼠生殖系統(tǒng)的熱應(yīng)激模型， 對(duì)大鼠睪丸中的HSPA2 及幾種HSF 作定量分析，以期進(jìn)一步揭示熱應(yīng)激致精子發(fā)育功能障礙的可能機(jī)制， 同時(shí)可為熱應(yīng)激造成男性不育的基因治療和新藥研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

16 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8 周齡，體重約180～210g，均安置在帶有松木屑?jí)|層的聚碳酸酯籠子中，飼養(yǎng)于 以12 小時(shí)為周期明/暗交替、 溫度及濕度可控的房間內(nèi)，SPF 級(jí)大鼠維持飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，2010250213）及飲水可自由獲取。 陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心為重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局計(jì)量認(rèn)證合格單位，由重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心作公正性申明。 動(dòng)物飼養(yǎng)及操作嚴(yán)格遵守陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與利用專業(yè)委員會(huì)有關(guān)規(guī)定。 本研究所用動(dòng)物及使用已獲陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要儀器與試劑

HOPE-MED 8150E 型特定環(huán)境智能型模擬實(shí)驗(yàn)艙（天津合普公司），CFX Connect 實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），PowerPac Basic 基本型電源電泳儀、ChemiDoc Touch 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）， 熒光定量PCR 試劑盒2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）（擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，TSE201），HSPA2 特異性單克隆抗體（華安生物技術(shù)有限公司，ET1701-15），HSF1 多克隆抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-3757R），HSF2 多克隆抗體（博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1409R），HSF5 多克隆抗體（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，PA5-69484），HSFY 多克隆抗體（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，PA5-28352），次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase,HPRT） 單克隆抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，JU03-26），HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，70-GAR007）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

將16 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)等分為熱應(yīng)激組和對(duì)照組。 開(kāi)啟HOPE-MED 8150E 型特定環(huán)境智能型模擬實(shí)驗(yàn)艙（以下簡(jiǎn)稱高溫艙），設(shè)定溫度為43℃，待艙內(nèi)溫度上升至設(shè)定值并穩(wěn)定片刻后，將熱應(yīng)激組8只大鼠連同聚碳酸酯籠子（撤去飼料及飲水） 一起置入，計(jì)時(shí)30 分鐘后取出。 對(duì)照組8 只大鼠除不進(jìn)行熱應(yīng)激處理外，其余處理與熱應(yīng)激組完全相同。

（二）取材

熱應(yīng)激組大鼠于高溫艙內(nèi)取出后3 小時(shí)（鑒于3小時(shí)為熱應(yīng)激模型的關(guān)鍵時(shí)相點(diǎn)之一[11-13]），處死所有大鼠，將其仰臥放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用外科剪剪開(kāi)其下腹部皮膚層及肌肉層后， 以鑷子向頭側(cè)方向牽引下腹部脂肪組織，待雙側(cè)睪丸顯露后，分離出附睪及周?chē)窘M織，將取下的睪丸組織分裝編號(hào)，先以液氮速凍，再保存于-80℃。

（三）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT 基因mRNA 的表達(dá)

HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT（內(nèi)參）基因引物序列如表1 所示， 所有引物均由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。 將取材于熱應(yīng)激組和對(duì)照組大鼠的睪丸組織全部自-80℃取出，各稱取約20 毫克，使用RNAprep Pure Tissue Kit 法提取大鼠睪丸組織總RNA，經(jīng)Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 法逆轉(zhuǎn)錄得到各自的cDNA，最后使用表1 所示引物，根據(jù)2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 分鐘；95℃10 秒，57℃10 秒，72℃30 秒，共40 個(gè)循環(huán)）。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)熔解曲線及其變化率曲線進(jìn)行分析，觀察是否存在非特異性擴(kuò)增。 根據(jù)反應(yīng)所得Ct 值，以HPRT 為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt 法計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

（四）Western blot 法檢測(cè)睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 及HPRT 蛋白的表達(dá)

于-80℃取出全部16 份大鼠睪丸組織樣本， 各稱取約100 毫克置于EP 管中， 依次加入1ml RIPA 裂解液，10μl PMSF，提取總蛋白。將待測(cè)樣品依次加入上樣孔進(jìn)行電泳，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜7 min，封閉約1.5 h。根據(jù)目的蛋白條帶所在位置裁剪PVDF 膜后， 加入到對(duì)應(yīng)的一抗溶液中，4℃孵育過(guò)夜。 經(jīng)TBST 洗滌3 次（20min/ 次）后，加入二抗溶液中，4℃孵育約1.5 h。 經(jīng)TBST 洗滌3 次（20min/ 次）后，置于ChemiDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照。 以HPRT 為內(nèi)參，各目的蛋白表達(dá)量以相對(duì)灰度值表示。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各目的蛋白和內(nèi)參蛋白上樣體積、一抗及二抗稀釋比例見(jiàn)表2。

表2 目的蛋白及內(nèi)參蛋白上樣體積、一抗及二抗稀釋比例

（五）數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析。 本研究對(duì)大鼠分組采用的是完全隨機(jī)法， 熱應(yīng)激組與對(duì)照組為兩組獨(dú)立樣本。 分別對(duì)兩組數(shù)據(jù)作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若符合參數(shù)檢驗(yàn)條件則使用T 檢驗(yàn)，不滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件時(shí)使用非參數(shù)檢驗(yàn)法。 對(duì)于檢驗(yàn)結(jié)果的解讀：若P＞0.05 則判定差異不顯著，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；若P＜0.05 則判定差異顯著，P＜0.01 則判定差異極顯著，此二者結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 使用GraphPad Prism 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

結(jié) 果

一、熱應(yīng)激對(duì)大鼠睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 表達(dá)量的影響

熱應(yīng)激組與對(duì)照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示。與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組HSPA2（P＜0.0001，1A）、HSF2（P=0.0006，1C）及HSFY（P=0.0002，1E）的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低，HSF1（P=0.0102，1B）與HSF5（P=0.0237，1D）的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。

二、熱應(yīng)激對(duì)大鼠睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白表達(dá)量的影響

熱應(yīng)激組與對(duì)照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白的檢測(cè)結(jié)果及其相對(duì)表達(dá)圖如圖2、圖3 所示。熱應(yīng)激組與對(duì)照組HSPA2（P=0.5624，3A）、HSF1（P=0.3292）、HSF2（P=0.9928，3C）、HSF5（P=0.8118，3D）、HSFY（P=0.6864，3E）的表達(dá)量無(wú)顯著差異。

圖1 熱應(yīng)激組與對(duì)照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

圖2 熱應(yīng)激組與對(duì)照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白的Western 印跡圖

圖3 熱應(yīng)激組與對(duì)照組睪丸組織中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5、HSFY 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

討 論

男性不育問(wèn)題已在全球范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注，而造成男性不育的關(guān)鍵因素就是精子質(zhì)量的下降。 精子的發(fā)生及其成熟是極其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程， 因此導(dǎo)致精子發(fā)育功能障礙的因素也可能是多方面的， 而高溫正是其中之一。 既往研究從不同角度回答了熱應(yīng)激導(dǎo)致精子數(shù)量減少的內(nèi)在原因， 但熱應(yīng)激致精子活性及運(yùn)動(dòng)能力損傷的本質(zhì)原因卻少見(jiàn)報(bào)道。 據(jù)此推測(cè)，熱應(yīng)激致精子發(fā)育損傷可能涉及到更多不同的機(jī)制。

現(xiàn)有研究表明，在睪丸中大量表達(dá)的HSPA2 表達(dá)異常或功能障礙，都會(huì)顯著地影響精子發(fā)育，這種影響不僅體現(xiàn)在精子發(fā)生的過(guò)程中， 還體現(xiàn)在精子功能轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，最終可能導(dǎo)致精子數(shù)量減少、形態(tài)異常以及功能障礙[9]。 此外，有研究指出，HSF 也與精子發(fā)育過(guò)程緊密相關(guān)， 被單獨(dú)敲除HSF1 或HSF2 的雄性小鼠，其精子數(shù)量明顯減少， 頭部形態(tài)異常的精子數(shù)量明顯增多，有趣的是，這些雄性小鼠的生育能力并未顯著降低， 但被同時(shí)敲除HSF1 和HSF2 基因的雄性小鼠，則因精子發(fā)生完全受阻而表現(xiàn)為絕對(duì)不育[10]。 綜上所述，我們認(rèn)為HSPA2 及HSF 很可能在熱應(yīng)激過(guò)程中介導(dǎo)了精子損傷的發(fā)生。 本研究選擇在睪丸中高量表達(dá)的HSPA2，在睪丸中特異性表達(dá)的HSF5 和HSFY，主要在睪丸中表達(dá)的HSF2 以及介導(dǎo)熱休克反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HSF1 作為重點(diǎn)研究指標(biāo)，試圖通過(guò)構(gòu)建大鼠熱應(yīng)激模型， 從動(dòng)物水平上探索熱應(yīng)激致精子發(fā)育功能障礙的可能機(jī)制。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)了熱應(yīng)激組與對(duì)照組HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組HSPA2（P＜0.0001，1A）、HSF2（P=0.0006，1C）及HSFY（P=0.0002，1E）的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于熱應(yīng)激組，HSF1（P=0.0102，1B）與HSF5（P=0.0237，1D）的相對(duì)表達(dá)量顯著高于熱應(yīng)激組。 Krawczyk 等研究發(fā)現(xiàn)，為大鼠實(shí)施隱睪術(shù)后2 天，檢測(cè)到2.5 kb RNA（即HSPA2）顯著降低，該發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果中熱應(yīng)激致HSPA2 基因mRNA 表達(dá)下調(diào)相一致， 同時(shí)也可能為臨床上常見(jiàn)的隱睪或可回縮睪丸（睪丸常位于陰囊與腹股溝管之間，將捫及的睪丸逐漸推入陰囊內(nèi)， 松手之后睪丸能在陰囊內(nèi)停留， 并非隱睪）所致的生育功能障礙提供一定的解釋，但從本質(zhì)上講，無(wú)論是暴露于高溫環(huán)境，施行隱睪術(shù)，還是先天性隱睪或可回縮睪丸都客觀上破壞了精子發(fā)育的最佳條件[14]（通常陰囊內(nèi)部溫度比核心體溫大約低2～7℃），均可能通過(guò)誘導(dǎo)熱應(yīng)激反應(yīng)致使HSPA2 表達(dá)下調(diào)，并進(jìn)一步影響正常精子發(fā)育。 既往研究表明，HSF1 是熱休克反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。 生理?xiàng)l件下，它以無(wú)活性的單體形式存在于與HSP 及其他蛋白質(zhì)的復(fù)合體中。 應(yīng)激條件下，其可從與之相結(jié)合的復(fù)合體中解離，這些非結(jié)合單體可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂修D(zhuǎn)錄活性的三聚體。 在多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織(如肝、腎、肺)中，HSF1 在41℃或更高溫度下才會(huì)激活， 而在睪丸中，HSF1 在較低溫度(35～38 ℃)下即可被激活。 有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下睪丸中HSF1 基因mRNA 的表達(dá)量實(shí)際是下調(diào)的。 有研究顯示，HSF1 在熱應(yīng)激下可能具有兩種完全相反的功能， 其在耐熱細(xì)胞中（大多數(shù)體細(xì)胞皆屬此類）可激活保護(hù)性HSP 的表達(dá)，此時(shí)促凋亡蛋白的表達(dá)是受阻的， 而在熱敏感細(xì)胞中則可激活促凋亡蛋白的表達(dá)，此時(shí)保護(hù)性HSP 的表達(dá)是受阻的。 既往研究表明， 活化的HSF1 并未在減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的生精細(xì)胞中誘導(dǎo)保護(hù)性HSP 表達(dá)，相反，HSF1 通過(guò)激活促凋亡蛋白(PMAIP1,PHLDA1)表達(dá)，最終導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡[10]。 顯而易見(jiàn)，睪丸中的生精細(xì)胞（主要指減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的生精細(xì)胞）屬于熱敏感細(xì)胞。盡管熱應(yīng)激下HSF1 表達(dá)下調(diào)的內(nèi)在機(jī)制尚不得而知，但如前所述， 當(dāng)活化的HSF1 在熱敏感的生精細(xì)胞中介導(dǎo)凋亡途徑時(shí)，保護(hù)性HSP 的表達(dá)受阻。 因此，我們似乎可以作出一個(gè)合理的推測(cè)， 即HSF1 的表達(dá)下調(diào)與保護(hù)性HSP 的表達(dá)受阻很可能具有某種內(nèi)在關(guān)聯(lián)，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。盡管單獨(dú)敲除HSF1 或HSF2 并沒(méi)有對(duì)雄性小鼠的生育能力造成顯著影響， 但同時(shí)敲除HSF1 和HSF2 時(shí)直接導(dǎo)致了雄性小鼠的絕對(duì)不育。造成這種奇怪現(xiàn)象的一個(gè)可能原因是，HSF1 和HSF2之間具有功能互補(bǔ)性。 不難發(fā)現(xiàn)，HSF1 和HSF2 與精子發(fā)育也具有緊密關(guān)聯(lián)， 盡管其調(diào)節(jié)精子發(fā)育的具體機(jī)制目前尚不明確， 但可以推斷兩者表達(dá)水平同時(shí)降低極可能會(huì)影響正常的精子發(fā)育。關(guān)于HSF5 和HSFY的功能目前尚少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道， 但作為睪丸中特異性表達(dá)的兩種熱休克轉(zhuǎn)錄因子， 其對(duì)精子發(fā)育的作用值得深入探討， 對(duì)其作用的揭示也有助于闡明熱應(yīng)激致精子發(fā)育功能障礙的內(nèi)在機(jī)制。綜上所述，我們推測(cè)熱應(yīng)激很可能通過(guò)下調(diào)HSPA2、HSF1、HSF2 的表達(dá)介導(dǎo)精子損傷的發(fā)生。 值得注意的是，HSF5 和HSFY 的表達(dá)也顯著下調(diào)了， 但關(guān)于兩者在精子發(fā)育中的確切作用還有待進(jìn)一步研究。

本研究WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 熱應(yīng)激組與對(duì)照組HSPA2（P=0.5624，3A）、HSF1（P=0.3292）、HSF2（P=0.9928，3C）、HSF5（P=0.8118，3D）和HSFY（P=0.6864，3E）蛋白相對(duì)表達(dá)量均未見(jiàn)顯著差異， 與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的結(jié)果不一致。 原因可能是多方面的。 第一，既往研究表明HSF 可經(jīng)歷多種翻譯后修飾，如磷酸化、乙酰化、蘇素化、泛素化等，而HSPA2 也可發(fā)生翻譯后修飾[15]。 熱應(yīng)激可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的翻譯后修飾狀態(tài)， 進(jìn)而影響其抗原性，并最終對(duì)WB 的定量結(jié)果造成干擾。 第二，基因表達(dá)包含了轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)層面， 而轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)是存在時(shí)空間隔的， 所以一個(gè)可能的原因是， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中處死大鼠的時(shí)間點(diǎn)HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 蛋白表達(dá)尚未發(fā)生顯著差異。 第三，相比于WB 檢測(cè)蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)mRNA 的靈敏度要高很多，因此在本實(shí)驗(yàn)中，熱應(yīng)激組與對(duì)照組蛋白的相對(duì)表達(dá)值可能已經(jīng)存在實(shí)質(zhì)性差異，只是WB 未能檢出。 第四，實(shí)驗(yàn)樣本量太少或樣本之間的個(gè)體差異性太大，或樣本的代表性不足，也可能是導(dǎo)致WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果不一致的重要原因。 總之，本研究尚存在諸多不足之處，我們將在后期研究中進(jìn)一步探索。

綜上所述， 本研究證實(shí)熱應(yīng)激導(dǎo)致大鼠睪丸中HSPA2、HSF1、HSF2、HSF5 及HSFY 基因mRNA 表達(dá)量顯著下調(diào)，提示熱應(yīng)激很可能通過(guò)下調(diào)HSPA2 及系列HSF 的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)精子損傷的發(fā)生，可為臨床上男性不育的基因治療和新藥研發(fā)提供有價(jià)值的理論參考。 如前所述，HSF 是調(diào)控HSP 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，但迄今為止HSPA2 是否接受HSF 的調(diào)控尚無(wú)定論。 盡管HSF1 和HSF2 對(duì)精子發(fā)育的影響研究已取得部分進(jìn)展，但其影響精子發(fā)生的具體機(jī)制不明。研究表明[16]，表觀遺傳機(jī)制可能是調(diào)控HSPA2 基因表達(dá)的首要因素，但熱應(yīng)激過(guò)程中是否也涉及到類似的機(jī)制，值得探討。總之，HSPA2 及HSF 在熱應(yīng)激過(guò)程中表達(dá)下調(diào)的本質(zhì)原因尚有待進(jìn)一步研究。