重度少精子癥伴高碎片化精液精子和睪丸精子行ICSI 助孕后臨床結局分析

張明亮 鄭小挺 薛 潔 馬 玲 姚文亮 熊 奇 陳勝輝

南昌市生殖醫院，江西中醫藥大學附屬生殖醫院（江西南昌 330000）

隨著社會經濟的快速發展， 在眾多因素的影響下，不孕不育的發病率呈逐年上升的趨勢， 而根據有關報道發現，因男方因素引起的不孕不育約占一半[1]。 在過去，診斷男性不育癥主要依賴精子濃度、活動率及精子形態學分析等參數，因其相應診斷存在一定的局限性，臨床接診過程中仍有一部分不育患者難以確定不育原因， 普通的精液相關檢測無法反映男性生育力的真實水平。 因此，需要一個新的評估男性生育力指標。 隨著精子DNA 碎片檢測的出現， 精子DNA 結構的損傷引起男性不育受到生殖界的關注。有學者提出DNA 結構高度完整的精子對于成功受精和維持正常的胚胎發育是必需的[2]。精子自身沒有DNA 修復機制，而染色質結構的完整性是正常受精、胚胎發育與妊娠的前提條件[3，4]。研究報道，精子DNA 損傷是精子染色質結構異常的一個重要特征，是造成男性不育、受精率、優質胚胎率、復發性自然流產以及ART 治療失敗的重要原因之一[5，6]。重度少精子癥患者往往選擇卵泡漿內單精子注射（ICSI）助孕治療，學者認為伴有高DNA 碎片化（DNA fragmentation index，DFI）可能會對患者助孕的臨床結局有一定的影響， 同時也增加了攜帶有缺陷的基因的精子進行受孕的機會， 高DFI 精子直接注射到卵細胞的胞漿內，導致受精率、胚胎率及流產率等影響。 基于上述理論，重度少、弱精子伴有高DFI 患者選擇精子的方式是臨床上關注的重點，本研究擬觀察重度少、弱精子伴有高DFI 患者精液精子和睪丸精子行ICSI 助孕后臨床結局的比較，探討一種臨床結局較好的取精方式。

討 論

一、研究對象

選取南昌市附屬生殖醫院生殖男科門診2017 年4月至2018 年4 月行ICSI 助孕治療的82 例患者， 其中有3 例患者因各種因素取消移植， 本研究納入標準：1）患者屬于重度少精子癥（＜500 萬/mL， 世界衛生組織《WHO 人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版）同時伴有精子DNA 碎片異常（DFI＞15%）；2）女方單純輸卵管因素，生育力評估基本正常，卵巢功能、宮腔環境良好及無免疫性疾病；3）男女雙方染色體正常，男性無外傷、無遺傳史，無性功能障礙及生殖系統感染等。

二、研究方法

（一）分組情況

將82 例患者按隨機分組法分為睪丸精子組42例： 在女方取卵當日男方行睪丸顯微取精術（Microtesticular sperm extraction，M-TESE）， 將獲取的適量精子行ICSI 助孕；精液精子組40 例：在女方取卵當日，男方在禁欲7 天內行手淫取出新鮮精液送實驗室處理后行ICSI 助孕； 兩組患者取精前和取精后分別檢測其精子DNA 碎片情況。

（二）精子、卵子標本

1. 精子標本：睪丸組精子獲取實行顯微取精術：全麻后在顯微鏡下沿著睪丸赤道線切開睪丸白膜， 暴露出曲細精管， 在高倍顯微鏡下選取較為飽滿粗大發亮的曲細精管，滴入適量的培養液，立即送往實驗室，由實驗室工作人員撕開曲細精管后， 在倒置的顯微鏡下發現適量活動的精子備用； 精液組精子在禁欲7 天內由患者手淫獲取新鮮精液送實驗室檢測處理備用；

2. 卵子標本： 納入標準的女方均采用改良超長方案促排卵， 在月經周期第二天皮下注射醋酸亮丙瑞林微球(貝依)3.75mg，注射日開始計算，35 天后返院予以靜脈注射尿促卵泡素150～300IU 和尿促性腺激素75～150IU， 超聲發現當有1 個卵泡直徑≥1.8cm 或2 個卵泡平均直徑≥1.7mm 時停止用藥，當晚21 點肌注絨促性腺激素8000 單位，36～38h 后在陰道B 超引導下行取卵術，并記錄取卵情況和獲卵數。

（三）DFI 檢測

兩組患者囑咐禁欲7 天內進行取精， 流式細胞儀檢測DFI， 其中試劑盒購自浙江星博生物科技有限公司。 嚴格按照試劑說明標準化操作，在高倍顯微鏡下觀察500 個精子，記錄存在DNA 碎片精子的個數。 精子是否存在DNA 碎片的標準:精子頭部僅產生較小光暈或無光暈， 單側光暈厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。 計算DFI（%）=存在DNA 碎片精子數/ 被觀察精子的總數×100%。

（四）ICSI 獲取精子和取卵后， 在倒置顯微鏡下利用顯微注射針將精子注射到卵泡漿內， 觀察受精和評估胚胎情況。

（五）胚胎移植 所有受試患者均采取3 日齡卵裂胚移植，觀察移植后情況。

（六）臨床結局 記錄卵裂胚移植后12d，行血絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，HCG）檢查，陽性者為生化妊娠，移植后5 周行B 超檢測，宮內可見孕囊、胚芽及胎心者確診為臨床妊娠。

（七）觀察指標

1.睪丸組M-TESE 后精子DNA 碎片變化情況；

2.兩組精子ICSI 后受精率、優質胚胎率、可用胚胎數、流產率和抱嬰率情況。

（八）統計學分析

兩組患者所涉及的數據均采用SPSS17.0 軟件統計分析，其中計數資料采用卡方檢驗；計量資料符合正態分布采用均數±標準差（x±s），并采用兩組獨立樣本t檢驗計算，P值大于0.05 被認為無統計學意義，反之具有明顯差異，有統計學意義。

結 果

一、試驗基本情況

本次試驗共有82 例受試患者納入，在睪丸組和精液組的所有受試患者中， 試驗周期內患者因個人原因或其他原因未移植的，睪丸組2 例，精液組1 例，共3例患者， 均作剔除處理， 完成整個試驗的， 治療組40例、對照組39 例。

二、兩組受試患者基本情況比較

其中兩組患者的年齡、不育年限、精子濃度及精子碎片情況比較無統計學差異，（P＞0.05），見表1。

表1 兩組基本情況對比

三、睪丸精子組患者睪丸取精前后精子碎片情況比較

其中睪丸獲取精子后再次檢測碎片發現精子碎片率明顯低于精液組精子， 對照組精液精子和治療組睪丸精子DFI 分別為27.55±4.78 和6.70±1.98，（P＜0.01）比較具有統計學差異；

四、兩組患者ICSI 助孕后臨床結局對比，見表2。

表2 兩組患者受精和胚胎情況對比

五、兩組患者ICSI 助孕后臨床結局對比，見表3。

表3 兩組患者臨床結局對比

討 論

DFI 作為評估男性生育力的新指標在ART 助孕中有著重要的指導意義，為男性不育的診療開拓了新的思路。 國內外有研究表明DFI 與精液常規質量、精子形態學等存在相關性[7-9]，也有研究認為DFI＞30%影響不育及妊娠率， 當DFI＞30%時ICSI 助孕可能是首選的助孕方法[10，11]。相關研究發現精子DFI 增高導致ICSI 助孕的生化妊娠率及流產率增高， 而對臨床妊娠率無明顯影響，而高DFI 精子行ICSI 助孕與體外受精（In Vitro Fertilization，IVF）助孕相比較，其臨床妊娠率和種植率明顯高于后者，有統計學差異，對于高DFI 患者ICSI 可作為一種較好的助孕選擇方式[12，13]。 柳祖波等[14]研究報道探討725 例不孕夫婦病例中， 發現精子DNA 碎片對IVF結局基本無影響， 但與ICSI 結局中的可用胚胎率和優質胚胎率呈負相關，并認為這可能與受精過程中IVF 周期中卵子對精子有自然選擇的過程， 而ICSI 周期中則是與人為的選擇精子有關。 也有Carlini T 等[15]針對意大利反復流產的夫婦研究中評估DFI 發現，男性精液DFI水平與不育組相似，高于正常生育組，但其認為不能以單純的DFI 作為反復流產風險的預測指標。 Oleszczuk K 等[16]研究認為當DFI 值＞40%以上，流產率會明顯上升， 其檢測可作為選擇ART 受精方式方法， 高碎片精子，選擇ICSI 可能會是更好的方法。 但上述結論尚未得到統一，目前的男性不育及ART 診療共識中，尚未納入適應證范圍內，目前仍未得到國際上一致認可的結論。

而在少精子癥伴有高DFI 患者中， 有研究觀察發現其睪丸內獲取的精子DFI 明顯低于射出精子， 研究中經末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP 鎳端標記(TUNEL)法檢測的DFI 在射精時顯著高于睪丸精子，有統計學差異， 認為睪丸內精子受到外界的損傷程度較小，也有研究認為睪丸精子提取和ICSI 在高DFI 不育男性中具有協同作用， 睪丸精子注射ICSI 助孕后懷孕率明顯高于射精后ICSI 助孕[17，18]。而Ben-AmiI 等[19]研究17 例隱匿性精子癥伴有高碎片的患者中，結果發現使用睪丸精子的分娩率明顯高于精液精子。 雖然在高DFI 患者中，有觀察發現使用ICSI 助孕比使用IVF 助孕后更容易受孕， 這可能與治療的人群和每種方法中使用精子處理技術的不同有關[20]。 有報道涉及2,969 對夫婦的薈萃分析中發現，當DFI比例異常高的精液樣本被用于ICSI 時， 流產的風險增加了2.16 倍[21]。 這與我們的研究中的情況一致，結合本次研究數據中發現，也驗證了上述學者們的觀點，少精子癥伴有高DFI 患者中的睪丸獲取精子的DFI 明顯低于精液精子，而行ICSI 助孕后受精率對比無差異，但胚胎質量和臨床結局等情況具有明顯差異。 數據顯示，精液精子組有較高的流產率，睪丸精子有較好的臨床結局。

有Ollero M,Alvarez JG 等學者[22，23]認為DNA 損傷主要是睪丸后發生的事件，DNA 結構的損傷可以在睪丸精子中發現，是因為直接減數分裂失敗或早期染色質缺陷裝配， 但絕大多數的DNA 損傷是在射精中觀察到的。 故而驗證了睪丸精子的DFI 要明顯低于精液精子。然而，隨著顯微外科的發展，在以往的非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia，NOA） 患 者 中 通 過M-TESE 獲取的精子行ICSI 助孕后產下的新生兒是安全可靠的，但這些數據僅涉及NOA 患者的收集，而在少精子癥伴有高DFI 患者中使用睪丸精子助孕需要持續的監測，直到該選擇精子方法的安全可靠性得到認可。

綜上所述，本次研究的結果表明，對重度少精子癥伴有高DFI 患者， 選擇睪丸精子助孕具有較好的臨床結局， 為臨床上高DFI 患者選擇ART 助孕技術以外，提供一種更為安全可靠的精子選擇方式。