大腸桿菌混菌發酵生產咖啡醇糖苷

王帥，莊以彬，劉浩，畢慧萍*，劉濤

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(中國科學院天津工業生物技術研究所，天津，300308)

糖苷類化合物是次級代謝中最重要的天然產物之一[1]。糖基化通常會對化合物的理化和生物特性產生顯著影響，包括溶解性、穩定性和生物活性等[2]，使糖苷成為更具吸引力的化合物，廣泛應用于藥物、食品添加劑和保健品等領域[3]。以珍稀藏藥紅景天活性成分紅景天苷為例，它具有抗氧化、抗疲勞和抗衰老的等作用，被廣泛添加于食品和保健品中[4]。因此，紅景天苷類似物的木質素單體醇糖苷引起了我們的注意。構效關系研究表明，木質素單體醇糖苷的生物活性受到苯環上羥基的數量和位置、酚羥基上甲氧基的引入以及糖連接類型的影響[5-8]，因此，作為在苯環上具有2個羥基單元的咖啡醇糖苷，可能顯示出更優的生物學和藥理學活性。但是目前咖啡醇糖苷的獲取仍是巨大的挑戰，雖然有報道從玉簪花(Hostaplantaginea)中分離出較低含量的天然咖啡醇-4-O-葡萄糖苷[9]，也有報道利用化學還原途徑，從相應的苯基丙酸生產木質素單體醇及其糖苷衍生物[10]，但植物提取和化學合成受限于起始資源、繁瑣的程序和較低的產量，從而限制了咖啡醇糖苷的研究和應用。

近幾年，隨著合成生物學的發展，利用微生物發酵生產植物天然產物和高價值化學品成為一種具有廣闊應用前景的生產方式[11]。2016年，CHEN等[12]將工程化的大腸桿菌進行共培養來合成一系列木質素單體醇。2019年通過構建人工生物合成途徑，實現了在大腸桿菌中生產肉桂醇糖苷及對香豆醇單-雙糖苷[13]。這使得通過微生物高效生產咖啡醇糖苷成為可能。

本文旨在利用微生物細胞工廠發酵生產咖啡醇葡萄糖苷(合成途徑見圖1)。因羥化酶HpaBC具有底物寬泛性，易將酪氨酸氧化為不穩定的中間體L-多巴，從而導致碳源的流失[12]，所以本研究采用共培養策略，降低HpaBC對酪氨酸的轉化。首先，在酪氨酸高產大腸桿菌菌株BTAL[13]中引入來自粘紅酵母的酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase,TAL)，來自歐芹的對羥基肉桂酰輔酶A連接酶(4CL)，來自擬南芥的肉桂酰輔酶A還原酶(cinnamyl-coa reductase,CCR)，并利用大腸桿菌內源性醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADHs)或醛酮還原酶(aldosterone reductase,AKRs)，構建了對香豆醇的生物合成途徑，該重組菌株命名為BTAL-CAD01。然后，將來自大腸桿菌的羥化酶HpaBC和來自擬南芥的葡萄糖基轉移酶UGT73C5在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，得到重組菌株BWT-CAD01。通過共培養重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01成功實現了咖啡醇葡萄糖苷的生產。據我們所知，這是關于微生物發酵生產咖啡醇葡萄糖苷的首次報道，為后續構效分析提供了新的候選化合物，有望得到具有較好生物活性的咖啡醇糖苷化合物，也為生物發酵法廉價生產咖啡醇糖苷提供借鑒意義。

圖1 咖啡醇葡萄糖苷的生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathway from glucose to caffeyl alcohol glucosides

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒(表1)

大腸桿菌DH5α用于克隆攜帶特定基因的質粒，大腸桿菌BL21(DE3)及其改造菌株用于蛋白質表達和目標化合物的合成，均由本實驗室提供。

表1 本研究使用的質粒及菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 大腸桿菌培養基

LB培養基用于分子克隆、種子液培養、誘導蛋白表達、2步發酵的第1步培養，包括：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

M9Y培養基用于兩步法發酵的第2步發酵培養。培養基配方：5×M9 緩沖液，200 mL；20% 葡萄糖 100 mL；0.025% 酵母提取物 700 mL；1 mol/L MgSO42 mL；1 mol/L CaCl20.1 mL。

5×M9 緩沖液的配方：Na2HPO4·12H2O 85.5 g；KH2PO415 g,NaCl 2.5 g；NH4Cl 5 g，補水至1 000 mL。

根據需要將50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素添加到培養基中。

1.1.3 酶與試劑

1 kb DNA Ladder，天津樂寶生物科技有限公司；DNA聚合酶、限制性內切酶、DNA連接酶、PCR所用酶以及ClonExpress?非連接酶依賴型的多片段一步克隆技術試劑盒等，南京諾唯贊生物科技有限公司；T4連接酶，賽默飛世爾公司；質粒小量提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、凝膠回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 主要儀器與設備

循環水式真空泵(SHB-ⅢA)，鄭州長城科工貿有限公司；旋轉蒸發儀(Hei-VAP.Value G3)，德國海道夫旋蒸儀公司；高效液相色譜制備系統(LC-6AD)，島津儀器(蘇州)有限公司；1260 Infinity UV檢測器和配備ESI電離探針的Bruker microQ-TOF II質譜儀的Agilent 1260系統，安捷倫科技有限公司和瑞士Bruker公司；核磁共振波譜儀Bruker Avance 400，瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒的構建

本研究中使用的所有引物均列于表2。HpaBC基因通過PCR從大腸桿菌BL21(DE3)的基因組DNA中擴增而來(重組質粒圖譜見圖2)。

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

圖2 重組質粒圖譜Fig.2 Maps of recombinant plasmids

通過使用限制性位點BamH I和EcoR I將HpaBC片段酶連插入pCDFDuet-1來構建pCDFDuet-HpaBC。利用引物73C5-5F/73C5-3R PCR，以根據大腸桿菌密碼子偏好性進行優化并合成的基因AtUGT73C5為模板進行PCR擴增，通過BamH I和SalI酶切AtUGT73C5片段，并連接到BamH I和SalI酶切的載體pRSFDuet-1中，得到重組質粒pRSFDuet-AtUGT73C5。重組質粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL-RgTAL的構建已在之前的工作中進行了描述[15]，重組質粒pCDFDuet-AtCCR-Pc4CL-RgTAL-HpaBC的構建與之前的工作[13]方法一致，添加的引物:RgTAL-3R、HpaBC-5F和HpaBC-3R。

1.2.2 微生物發酵生產咖啡醇糖苷

采用兩步發酵法生產目標化合物。在第1階段，將重組大腸桿菌菌株BTAL-CAD01、BWT-CAD01的單個克隆分別接種到5 mL液體LB培養基中，并在37 ℃以200 r/min培養過夜。然后將1 mL的BTAL-CAD01、BWT-CAD01種子液分別轉移至50 mL液體LB培養基中，37 ℃ 200 r/min培養至OD600達到0.6～0.8，并添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)在16 ℃，200 r/min培養12～16 h以誘導蛋白表達。然后于4 000 r/min離心10 min收獲細胞，用M9Y液體培養基將細胞重懸OD600值至2.0。在第2階段，將第1階段重懸后的BTAL-CAD01和BWT-CAD01細胞，以50 mL的總體積量，分別以7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3的體積比混合。于30 ℃ 200 r/min繼續振蕩培養發酵96 h,以一定時間間隔取樣，進行HPLC分析和OD600值測量。單菌BTAL-D發酵同樣采用50 mL總體積兩步發酵法。

1.2.3 化合物的純化

將2 L重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01的混合發酵液離心，收集上清液并用三菱SP825L型大孔吸附樹脂吸附，使用1體積(BV)不同體積分數的乙醇(10%、20%、30%、60%和80%)梯度洗脫目標化合物。利用HPLC分析確定洗脫液中含有目標化合物的成分，通過真空旋轉蒸發儀濃縮至干，最后將粗提取物重懸于3 mL甲醇中。利用半制備HPLC純化咖啡醇單糖苷。使用YMC-pack ODS-A(10 mm×250 mm,5 μm)進行化合物分離，洗脫條件除流速為4 mL/min外，其他與HPLC分析方法相同。

1.2.4 化學分析與定量

重組菌株的次級代謝產物使用配備有1260 Infinity UV檢測器和配備ESI電離探針的Bruker microQ-TOF II質譜儀的Agilent 1260系統,通過LC-MS分析。使用Innoval C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行HPLC分析?？Х却计咸擒盏南疵摋l件為：溶劑A，H2O(含體積分數0.1%甲酸)；溶劑B，甲醇；流速，1 mL/min；0～5 min，80%A和20%B，6～25 min，80%A和20%B到100%B(線性梯度)。25～30 min，100%B； 31～40 min，含20%B。所有產物均在254 nm波長處檢測到。MS分析以陽離子模式進行。用一系列已知濃度的發酵產生的純化的咖啡醇單糖苷化合物生成標準校準曲線。所有實驗一式3份進行，并重復至少2次，滴度表示為平均值±SD。

1.2.5 核磁共振分析

NMR實驗在Bruker Avance 400(德國卡爾斯魯厄)上進行，樣品溶于500 μL CD3OD。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌共培養生產咖啡醇單糖苷

用HpaBC和UGT73C5進一步擴展之前構建的對香豆醇途徑[15]來生產咖啡醇單糖苷。HpaBC廣泛存在于大腸桿菌B、C和W系基因組中，但相關報道證明通過誘導其過表達才能發揮羥化作用[12-15]。因羥化酶HpaBC具有底物寬泛性，易將酪氨酸氧化為不穩定的中間體L-多巴，從而導致碳源的流失[12]。所以單菌BTAL-D生產咖啡醇及其糖苷產量并不理想(圖3-a和圖6-a)。共培養策略旨在最大程度地降低HpaBC對酪氨酸的消耗(圖1)。在第1個培養階段，分別誘導了含有pCDFDuet-RgTAL-Pc4CL-AtCCR和pRSFDuet-1的重組大腸桿菌菌株BTAL-CAD01、含有pCDFDuet-HpaBC和pRSFDuet-AtUGT73C5的重組大腸桿菌菌株BWT-CAD01。然后將培養的BTAL-CAD01和BWT-CAD01的細胞以1∶1的比例混合并在第2階段共培養96 h。LC-MS檢測結果顯示，除咖啡醇(圖3-b，峰1)外，還產生了峰2、3和4三個新峰(圖3-b，峰2、3和4)，MS分析顯示化合物2、3和4具有相同的相對分子質量314.10，推斷為3個咖啡醇單葡萄糖苷(圖3-d～圖3-f)。為進一步確定3個咖啡醇單葡萄糖苷的結構，我們進行了2 L混菌發酵培養。

2.2 咖啡醇糖苷的分析與定量

將2 L重組菌株BTAL01和BWT01的混合發酵液離心，制備得到咖啡醇單糖苷，通過LC-MS和NMR分析確定并鑒定了2個咖啡醇單葡萄糖苷，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷和咖啡醇-9-O-葡萄糖苷的結構(圖4和圖5)。優勢單糖苷化合物4被證明是咖啡醇-4-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰4；圖4)，其最高產量在72 h內達到(126.98±2.42)mg/L(圖6-a)?；衔?經NMR分析鑒定為咖啡醇-9-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰3；圖5)?；衔?制備量不足，未進行NMR分析，因咖啡醇結構中共有3個—OH基團可被UGT73C5糖基化，化合物3和4已經鑒定為咖啡醇-9-O-葡萄糖苷和咖啡醇-4-O-葡萄糖苷，推斷化合物2為咖啡醇-3-O-葡萄糖苷?？Х却?3-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰2)和咖啡醇-9-O-葡萄糖苷(圖3-b，峰3)由于產量較低，未能定量。發酵72 h后，殘留有大量咖啡醇(圖3-b，峰1)。

a-HPLC分析重組菌株BTAL-D發酵上清液中的產物；b-HPLC分析共培養的重組菌株BTAL-CAD01和BWT-CAD01混合培養的發酵上清液中的產物；c-產物1(咖啡醇);d-產物2(咖啡醇-3-O-葡萄糖苷);e-產物3(咖啡醇-9-O-葡萄糖苷);f-產物4(咖啡醇-4-O-葡萄糖苷)圖3 大腸桿菌共培養生產咖啡醇單糖苷Fig.3 Production of caffeyl alcohol monoglucosides by E.coli co-culture

圖4 咖啡醇-4-O-葡萄糖苷氫譜和碳譜圖Fig.4 1H and 13C NMR spectrum of caffeyl alcohol-4-O-glucoside (4) in CD3OD

圖5 咖啡醇-9-O-葡萄糖苷氫譜和碳譜圖Fig.5 1H and 13C NMR spectrum of caffeyl alcohol-9-O-glucoside (3) in CD3OD

將樣品溶于500 μL CD3OD，進行核磁檢測，化學位移以δ(ppm)表示，耦合常數(J)以赫茲(Hz)給出：

化合物 3：1H-NMR(400 MHz，CD3OD) δ:6.88(1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 6.70(1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.73(1H, dd, J=8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.51(1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 6.12(1H, dt, J=15.9, 6.6 Hz, H-8), 4.48(1H, dd, J=12.5, 6.5 Hz, H-9a), 4.27(1H, dd, J=12.5, 7.0 Hz, H-9b), 4.36(1H, d, J=7.8 Hz, H-1′), 3.88(1H, dd, J=12.0, 2.1 Hz, H-6′a), 3.68(1H, dd, J=12.0, 5.3 Hz, H-6′b), 3.21～3.36(4H, m, Glu-H-2′, 3′, 4′, 5′).13C NMR(150 MHz, CD3OD) δ:129.0(C-1), 112.6(C-2), 144.9(C-3), 145.1(C-4), 114.8(C-5), 118.6(C-6), 133.0(C-7), 121.9(C-8), 69.6(C-9), 101.7(C-1′), 76.5(C-2′), 73.7(C-3′), 70.3(C-4′), 76.7(C-5′), 61.4(C-6′)。

化合物 4：1H-NMR(400 MHz，CD3OD) δ:6.96(1H, d, J=2.0 Hz, H-2), 7.15(1H, J=8.5 Hz, H-5), 6.86(1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz, H-6), 6.51(1H, d, J=15.8 Hz, H-7), 6.24(1H, dt, J=16.0, 5.7 Hz, H-8), 4.22(2H, d, J=7.0 Hz, H-9), 4.79(1H, d, J=7.0 Hz, H-1′), 3.93(1H, d, J=12.0 Hz, H-6′a), 3.75(1H, dd, J=12.0, 4.8 Hz, H-6′b), 3.33～3.53(4H, m, Glu-H-2′, 3′, 4′, 5′).13C NMR(150 MHz, CD3OD) δ:132.9(C-1), 113.2(C-2), 147.0(C-3), 145.0(C-4), 117.3(C-5), 118.2(C-6), 129.9(C-7), 127. 4(C-8), 62.3(C-9), 102.8(C-1′), 76.2(C-2′), 73.5(C-3′), 69.9(C-4′), 76.9(C-5′), 61.0(C-6′)。

2.3 優化發酵比例提高咖啡醇單糖苷的產量

為了提高咖啡醇單糖苷的產量，測試了BTAL-CAD01和BWT-CAD01的不同體積比混合比例(7∶1～1∶3)。結果顯示，當BTAL-CAD01和BWT-CAD01的混合體積比為3∶1,發酵72 h時，咖啡醇-4-O-葡糖苷的產量最高，達到(139.06±1.55) mg/L(圖6-a)，是單菌BTAL-D生產咖啡醇-4-O-葡糖苷產量(14.59±0.82) mg/L的9.53倍。當BTAL-CAD01和BWT-CAD01的體積比為3∶1，發酵72 h時，中間產物咖啡醇剩余量最少，為(96.78±3.16)mg/L，說明3∶1混合比例消耗了咖啡醇，促進了咖啡醇-4-O-葡糖苷的生產(圖6-a)，1∶3和單菌BTAL-D咖啡醇剩余量分別為(38.09±2.35)和(42.60±1.09) mg/L的原因是因為本身生產能力不足。在第2個發酵階段中，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的產量在48 h內迅速增加，然后在96 h內逐漸達到最高值(141.63±3.42) mg/L(圖6-b)。

圖6 通過優化大腸桿菌共培養比例提高咖啡醇單糖苷的生產Fig.6 Production optimization of caffeyl alcohol monoglucosides by E.coli co-culture

3 總結

微生物發酵法作為一種潛在而有效的技術已被用于不同天然產物的異源生物合成中[16]，它提供了一種綠色且可持續的方法。為了最大程度地減少HpaBC與酪氨酸接觸形成不穩定的中間體L-多巴，導致碳源的損失，本文設計共培養發酵的方法，合成了3種咖啡醇葡萄糖苷，同時測試了不同混合比例的BTAL-CAD01和BWT-CAD01來提高咖啡醇單糖苷的生產率，當二者混合比例設為3∶1時，咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的產量最高，是單菌生產咖啡醇-4-O-葡萄糖苷的9.53倍。后續可通過篩選挖掘底物選擇性更專一及催化活性更高的糖基轉移酶，并通過對莽草酸通路和UDP-糖通路的代謝調控，實現特定咖啡醇糖苷的高效合成。據我們所知，這是第一次實現微生物中咖啡醇糖苷的生物合成。除咖啡醇-4-O-葡萄糖苷以外，其他2種咖啡醇糖苷都是非天然化合物。作為在苯環上具有2個羥基單元的木質素單體醇糖苷，與其他木質素單體醇糖苷衍生物相比，咖啡醇糖苷有望表現出獨特的生物學和藥理活性。這些咖啡醇糖苷的非天然類似物將為構效關系研究提供基礎材料，并有望發現具有改善的生物活性和藥理特性的新類似物。