酶抑制法在農藥殘留快速檢測中的研究進展

王春瓊曾彥波李苓陳丹彭麗娟張燕

(1.云南省煙草質量監督檢測站,云南 昆明 650106；2.紅云紅河煙草(集團)有限責任公司會澤卷煙廠,云南 曲靖 654200)

前言

有機磷與氨基甲酸酯類農藥殘留常用的檢測方法為色譜法，如氣相色譜、高效液相色譜、氣-質聯用、液-質聯用等技術[1-5]。開發和推廣適合我國農產品產銷特點的檢測技術和方法，研究對現場農產品中農藥殘留進行快速篩查的檢測儀器和系統，對保證農產品的質量安全具有重要的意義。目前，主要速測的方法有速測箱、速測儀、速測卡和速測試劑盒等，這些方法按照技術原理的不同可分為化學法、酶抑制法和免疫法。其中，化學法由于靈敏度低而沒有普及；免疫分析法雖然靈敏度高、特異性強，但是抗體制備難度大，只能測定單一種類的農藥殘留，較難實現廣譜性。我國在21世紀初，研究了酶抑制快速檢測方法在基層推廣應用，此技術是基于氨基甲酸酯和有機磷類農藥對乙酰膽堿酯酶具有水解抑制作用的毒理學原理，建立的農殘快速檢測法，具有使用方便、操作簡單和成本低廉等優點，適合現場大量樣品的檢測和篩選[6,7]。

本文以酶抑制法為基礎，系統介紹了原理、酯酶種類、活性及其檢測方法，重點綜述了酶抑制法在農藥殘留快速檢測上的應用研究，并總結其存在問題，旨在為今后農藥殘留快速檢測方法相關研究提供參考。

1 酶抑制法的基本原理

氨基甲酸酯和有機磷類農藥為神經毒劑，會對人體、哺乳動物和昆蟲神經傳遞介質中的乙酰膽堿酯酶水解作用進行抑制，使乙酰膽堿酯酶的水解中斷，導致乙酰膽堿底物在體內累積，阻礙神經的正常傳導，引發中毒甚至死亡。酶抑制法便是基于氨基甲酸酯和有機磷類農藥對乙酰膽堿酯酶的這一毒理學原理應用到農殘檢測中。酯酶抑制率與氨基甲酸酯和有機磷類農藥濃度呈正相關，各種動物及植物都可用作酶源。將樣品與酯酶混合反應，若樣品不含農殘或含量極少，酯酶活性不受抑制，可將底物正常水解，通過電化學方法或光度法檢測水解底物；反之，若樣品農殘含量很高，酯酶活性受到抑制，不能水解底物或水解得較慢，通過測定抑制率推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農藥及濃度。

2 常用酯酶種類

2.1 昆蟲膽堿酯酶

昆蟲體內只有乙酰膽堿酯酶1種。據報道，從家繩、蜜蜂及麥二叉蚜等昆蟲中得到的乙酰膽堿酯酶已成功進行了分離、純化或部分純化。昆蟲體內的乙酰膽堿酯酶主要分布在胸部和頭部。敏感家蠅由于生活史短(16～18d)，容易飼養，通常被作為酶源材料。提取方法：在-20℃將家蠅冷凍至死后，加入少許干冰和磷酸緩沖液，勻漿、離心，取上清液過濾后冷凍保存備用。

2.2 動物血清酯酶

動物血液乙酰膽堿酯酶含量較高，且來源廣泛，廉價易得。已從鴨、馬和牛等動物血清中成功提取并純化出較高活力的乙酰膽堿酯酶。提取方法：將剛抽取的動物血液注入無抗凝劑的試管中，恒溫使血液凝團滲出血清，取血清離心，上清液冷凍保存備用。

2.3 動物肝酯酶

雞肝和豬肝常作為乙酰膽堿酯酶的酶源材料，分離純化方法與動物血清相同。豬肝中提取的乙酰膽堿酯酶對農藥的敏感性較好。提取方法：動物新鮮肝臟加蒸餾水勻漿、離心，取上清液在冷凍保存備用。

2.4 植物酯酶液

20世紀80年代以來，人們開始嘗試使用植物酶源替代動物酶源。植物酯酶活性雖不如動物酯酶高，但來源豐富、取材和制備方便、價廉易得、提取和保存較為方便、成本較低。研究結果表明，糧谷類的酯酶較其它植物含量較高，其中小麥的酯酶活性較高。提取方法：取市售面粉，按比例加入蒸餾水，振蕩、離心，取上清液過濾，濾液冷凍保存備用。

3 檢測方法

3.1 薄層-植物酶抑制法

農藥在薄板上展開后，噴面粉酶液，因為農藥抑制了斑點上的酶活性導致基質不能水解，而其它部分不被抑制，仍可使基質水解，故噴顯色基質溶液后可以顯色，通過斑點面積法進行半定量或使用薄層掃描儀進行定量分析。

3.2 速測卡法

農藥速測卡是在長方形紙條上，對稱貼圓形藥片白色、紅色各1片。白色藥片含膽堿酯酶，紅色藥片含2,6-二氯靛酚乙酸酯，在膽堿酯酶的催化下，2,6-二氯靛酚乙酸酯迅速水解，產生乙酸和2,6-二氯靛酚(藍色)。若含有機磷或氨基甲酸酯類農藥，膽堿酯酶的活性便會受到抑制而不水解，沒有藍色物質生成。根據白色藥片是否變藍，可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農藥及濃度。

3.3 分光光度法

3.3.1 丁酰膽堿酯酶法

碘化硫代丁酰膽堿在丁酰膽堿酯酶的催化下迅速水解，產生丁酸和碘化硫代膽堿，加入顯色劑二硫代二硝基苯甲酸，與碘化硫代膽堿發生顯色反應，產物呈黃色，在不同時間用分光光度計測定412nm處的吸光度變化值，計算抑制率。通過抑制率可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農藥及濃度。

3.3.2 乙酰膽堿酯酶法

在弱堿性溶液中，碘化硫代乙酰膽堿在乙酰膽堿酯酶的催化下迅速水解，產生碘化硫代膽堿。碘化硫代膽堿通過還原反應使藍色的2,6-二氯靛酚褪色，褪色程度與酯酶活性呈正相關，在600nm處測定吸光度，酶活性與吸光度值呈負相關。當樣品含氨基甲酸酯或有機磷類農藥時，會抑制酯酶活性，吸光度值越高。據此可推斷樣品是否含氨基甲酸酯或有機磷類農藥及濃度。

4 酶抑制法在煙草農藥殘留快速檢測中的應用研究

酶抑制法具有操作簡單、檢測快速、不需要大型儀器、檢測成本低廉等優點，適用于現場大批樣品的農殘快速篩查。1985年美國報道了一種能用于快速檢測田間有機磷和氨基甲酸酯類農藥的酶片，檢測范圍為0.1～10mg·kg-1。美國Neogen公司于1998年又推出了一種商品化試紙片，已經被用于空氣、水、土壤和食品等樣品農殘測定，國內市場也陸續推出如“農藥速測卡”和“農藥檢測卡”等產品。

國外方面，Young Ah Kim等[8]選用Hybond N+作酶的載體、苯基乙酸酯為酶促反應底物，用涂有AChE的試紙條檢測實際樣品中氨基甲酸酯和有機磷類農殘的含量，靈敏度為0.01～0.05mg·kg-1。Wang等[9]利用酯酶比色法對市售生菜中的5種有機磷農藥進行檢測。結果表明，小麥面粉中提取的酯酶對敵敵畏、甲胺磷、樂果、辛硫磷及馬拉硫磷的檢出限依次為0.17mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.11mg·kg-1、0.96mg·kg-1、1.70mg·kg-1。Ingrid Walt等[10]用酶標儀實現了多樣品中對氧磷和毒死蟀農殘含量的測定，檢出限依次為0.04mg·mL-1和2.6mg·mL-1。Supanat[11]基于酶抑制原理，制備了西維因農藥生物傳感器，檢測范圍為0.001～1mmol·L-1。Reddy[12]利用酶解釋放對硝基苯酚可抑制酶活性的特性，制備了測定甲基對硫磷的生物傳感器法，線性范圍為10～70ppb，檢出限為26.32ppb。Salam[13]以乙酰硫代膽堿碘化物為底物，利用殺蟲劑可抑制乙酰膽堿酯酶的特性，制備了電化學酶抑制傳感器，可用于稻田中殺蟲劑測定。Poacnik等[14]制備了一種光熱生物傳感器，用來檢測色拉、洋蔥等樣品中氨基甲酸酯和有機磷復合物，與GC-MS一致性較好。Tschmelak[15]制備了一種光學免疫傳感器，利用全內反射熒光設備來測量水樣中的農藥含量，靈敏度達到ng·L-1，可用作環境分析中的監測和預警。

國內方面，王繼軍[16]將自制植物酯酶涂覆在載體上的微孔內壁表面，制得農藥快速檢測板，靈敏度為0.1～0.01mg·kg-1。于基成[17]等通過比較大豆、玉米、綠豆等10種植物中植物酯酶活性，系統研究了酶促反應條件，建立了快速檢測蔬菜中有機磷農藥殘留的酶抑制法。何穎[18]等利用酶抑制分光光度法檢測蔬菜中有機磷農藥殘留量，回收率分別達到97%、101%和99%。錢立[19]等將電動流動分析與酶抑制法結合，研究了一種測定池塘水中氨基甲酸酯和有機磷類農殘折合總量的方法，每小時可測24個樣品。

姜彬等[20]基于酶抑制法制備出用于檢測有機磷農藥的電流型生物傳感器，檢測對硫磷、辛硫磷和氧化樂果的線性范圍分別為5×10-10×10-5mol·L-1、10-9～10-5mol·L-1和5×10-9～10-5mol·L-1，檢出限分別為3.24×10-10mol·L-1、1.26×10-10mol·L-1和6.60×10-9mol·L-1。劉濤[21]成功制備了用于測定毒死蜱、丙溴磷和馬拉硫磷的酪氨酸酶生物傳感器，檢測范圍為0.25～10ppb、l～10ppb和5～30ppb，檢出限分別為0.2ppb、0.8ppb和3.0ppb。

5 存在問題

酶抑制技術經多年發展，在農殘快速篩查上已得到廣泛運用，但仍存在諸多問題。酶抑制法只適用于有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測，且靈敏度有限；酶抑制法測定準確度的影響因素很多，如酶和底物來源及濃度、反應溫度、pH值、反應時間和天然抑制劑等，因此酶法測定的重現性不理想；常用的幾種酯酶中，乙酰膽堿酯酶的制備比較困難，并且保存時間短，酶失活較嚴重，酶的來源不穩定，不同來源的酶造成檢測結果的重現性和準確性較差。丁酰膽堿酯酶及植物酯酶雖然易得，但測定時專一性較差，假陽性率較高。