蚯蚓在生態(tài)毒理試驗(yàn)中的應(yīng)用研究

邵將 張宗鵬 謝宇震 孫倫濤 成德久

(安徽理工大學(xué)地球與環(huán)境學(xué)院，安徽 淮南 232000)

土壤安全是人類(lèi)一直關(guān)心的熱點(diǎn)問(wèn)題，由于其污染不易察覺(jué)且危害巨大，近年來(lái)，各種用于監(jiān)測(cè)土壤污染狀況、治理土壤污染的方法層出不窮。在這種情況下，以蚯蚓為受試生物，通過(guò)監(jiān)測(cè)各污染物對(duì)蚯蚓的毒害作用來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)生態(tài)環(huán)境危害程度的方法，即蚯蚓生態(tài)毒理試驗(yàn)[1]得到迅速發(fā)展。

蚯蚓在土壤中數(shù)量龐大，分布廣泛，更容易與土壤中各種污染物接觸[2]，且蚯蚓的表皮角質(zhì)層較薄，腺孔發(fā)達(dá)，對(duì)土壤中大多污染物較其它生物更為敏感，能很好地指示土壤污染狀況。此外，蚯蚓活動(dòng)可以改善土壤結(jié)構(gòu)，緩解土壤污染狀況，對(duì)改良土壤污染具有良好的應(yīng)用前景[3]。由于蚯蚓這些特點(diǎn)，加上蚯蚓易于養(yǎng)殖，容易采集，因此常被用于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量與外援污染物對(duì)土壤的影響。本文主要就生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)常用方法做簡(jiǎn)要介紹，同時(shí)從蚯蚓的改良作用、蚯蚓個(gè)體與微觀(guān)指標(biāo)對(duì)污染物的響應(yīng)機(jī)制來(lái)闡述蚯蚓在生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)中能夠起到的作用。

1 蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)方法

蚯蚓生態(tài)毒理試驗(yàn)研究方法眾多，本文主要就其中的實(shí)驗(yàn)室急性毒理試驗(yàn)、回避行為實(shí)驗(yàn)、在真實(shí)生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行的田間試驗(yàn)、生物檢測(cè)法和生物標(biāo)記法[4]進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

1.1 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)指蚯蚓經(jīng)1次或短時(shí)間內(nèi)多次給予受試物，通過(guò)測(cè)量致死和非致死的指標(biāo)參數(shù)，來(lái)表征污染物毒性效應(yīng)[5]。該方法簡(jiǎn)單、快速，應(yīng)用廣泛。目前，急性毒性試驗(yàn)廣為應(yīng)用的有以下4種方法。

1.1.1 濾紙接觸法

將赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia foetida)或安德愛(ài)勝蚓(Eisenia andrei)放置于玻璃瓶中(瓶中放有標(biāo)準(zhǔn)化濾紙條)，48h后測(cè)定其死亡率，并計(jì)算半致死濃度(LC50)[6]。此法簡(jiǎn)單易行，效率高，測(cè)試效果顯著；但此模式受制于污染物毒性信息只能通過(guò)皮膚接觸獲得，對(duì)環(huán)境中污染物的真實(shí)影響反饋難以準(zhǔn)確評(píng)估。

1.1.2 人工土壤試驗(yàn)法

在人工土壤中填充濃度不同的污染物，后將具有成熟環(huán)帶的赤子愛(ài)勝蚓或安德愛(ài)勝蚓置于其中，讓其暴露在污染物中，14d后觀(guān)察其行為和存活狀況，并計(jì)算出半致死量(LD50)[6]。此法較為繁瑣，且人工土壤組分還可能與被測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。但這種方法可以較為準(zhǔn)確地反映出蚯蚓在真實(shí)環(huán)境中受到污染物脅迫時(shí)的反應(yīng)，從而得出污染物的毒性效應(yīng)。

1.1.3 人造土壤試驗(yàn)

這種方法改良了人工土壤試驗(yàn)中土壤組分的問(wèn)題，以定形水合性二氧化硅粉和玻璃球(直徑1.5～2cm)代替人工土壤[7]，不僅大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，還杜決了土壤組分與被測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的可能，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1.1.4 自然土壤試驗(yàn)法

該法與人造土壤實(shí)驗(yàn)只有蚯蚓生活基質(zhì)的差別，采用自然土壤作為生活基質(zhì)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果能更為真實(shí)地反映出污染物對(duì)環(huán)境的影響，但是不同地區(qū)自然土壤性質(zhì)有差別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不具有可比性。

1.2 田間試驗(yàn)法

在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，通過(guò)觀(guān)察蚯蚓種類(lèi)、數(shù)量和生物量等指標(biāo)，測(cè)定某種污染物質(zhì)對(duì)蚯蚓種群影響的方法[1]。該方法能夠直接反映出污染物在自然界中的影響，但操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，且受地域環(huán)境限制較大，不同地區(qū)可比性較差。

1.3 生物檢測(cè)法

通過(guò)分析污染物殘留，對(duì)比污染區(qū)域與未污染區(qū)域(土壤類(lèi)型相同)蚯蚓個(gè)體與種群特征，闡明環(huán)境污染狀況[1]。該法費(fèi)用低廉，能夠直接反映出污染物對(duì)土壤生物的毒害作用，但是只能在污染發(fā)生后評(píng)估污染物毒性。

1.4 生物標(biāo)記法

根據(jù)污染物引起的蚯蚓生理、生化、體內(nèi)細(xì)胞和分子指標(biāo)的變化來(lái)判斷污染物環(huán)境影響的方法[6]。該方法能夠直觀(guān)準(zhǔn)確地反應(yīng)污染物對(duì)生物微觀(guān)結(jié)構(gòu)的影響，但費(fèi)用較高，且操作較為復(fù)雜。

1.5 蚯蚓回避行為實(shí)驗(yàn)

蚯蚓回避行為實(shí)驗(yàn)是以蚯蚓48h對(duì)某一濃度化合物的行為反應(yīng)來(lái)判斷其毒性。該方法省時(shí)省力、成本低廉，具有較高的反應(yīng)靈敏度[8]，而經(jīng)生物修復(fù)后的土壤污染物濃度較低，因此可以通過(guò)蚯蚓回避行為試驗(yàn)來(lái)確定污染土壤的生物修復(fù)效果。

2 蚯蚓強(qiáng)化污染土壤修復(fù)的能力

污染土壤的理化性質(zhì)惡劣，土壤肥力流失，蚯蚓活動(dòng)可以改良土壤，提升土壤肥力，改善土壤酸度，而且蚯蚓可以吞吃有機(jī)廢物，促進(jìn)土壤有機(jī)物質(zhì)的礦化。蚯蚓利用其特有的生理功能及其與環(huán)境中微生物的協(xié)同作用對(duì)有機(jī)質(zhì)進(jìn)行生物降解，將廢棄物中碳、氮、磷、鉀等養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為更利于植物吸收的形態(tài)，增強(qiáng)微生物多樣性，降低后續(xù)處置難度[9,10]。韓清鵬等發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活動(dòng)能夠提高不同土壤中氮素礦化量[11]；俞協(xié)治等[12]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活動(dòng)可以提升植物地上部分生物量，在一定條件下，能夠影響部分重金屬的有效性，間接影響植物對(duì)土壤重金屬的吸收，降低重金屬危害。

除蚯蚓自身作用外，蚯蚓糞在土壤修復(fù)方面也有巨大應(yīng)用潛力。蚯蚓糞富含有機(jī)質(zhì)和腐殖酸，可以增強(qiáng)地力，減少化肥施用，改良土壤板結(jié)；蚯蚓糞富含微生物菌群，對(duì)土壤的形成發(fā)育、物質(zhì)循環(huán)和肥力演變等均有重大影響；蚯蚓糞中的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌，能夠有效抑制植物性致病真菌[13]，有利于植物生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓糞可以通過(guò)提高葉綠素含量來(lái)有效地激活作物的光合作用，從而克服壬基酚脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。因此，蚯蚓糞除了降低土壤壬基酚的生物有效性外，還可以通過(guò)增強(qiáng)作物的抗逆性來(lái)幫助作物應(yīng)對(duì)壬基酚脅迫[14]。張燁、周東興[15,16]等發(fā)現(xiàn)，蚯蚓糞施加可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，并顯著增加土壤肥力。

3 蚯蚓個(gè)體對(duì)土壤污染物的響應(yīng)

蚯蚓對(duì)污染物較為敏感，當(dāng)污染物濃度達(dá)到一定程度時(shí)，蚯蚓會(huì)出現(xiàn)明顯的回避現(xiàn)象。徐冬梅等[17]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓對(duì)有機(jī)污染物與重金屬均會(huì)出現(xiàn)回避行為，且回避率與污染物濃度呈正相關(guān)。此外，蚯蚓的生長(zhǎng)繁殖也會(huì)受到污染物影響而產(chǎn)生變化，有研究發(fā)現(xiàn)，重金屬會(huì)導(dǎo)致蚯蚓體表潰爛[18]，且蚯蚓病變程度與重金屬含量息息相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中重金屬與有機(jī)污染物會(huì)使蚯蚓體重有較大程度下降[19,20]，不僅如此，污染物還會(huì)對(duì)蚯蚓生殖產(chǎn)生較大影響，使蚯蚓產(chǎn)繭量減少[21]，蚯蚓精細(xì)胞DNA損傷，精子畸形，并會(huì)導(dǎo)致前列腺、雄孔等器官病變[22]。故而，可以通過(guò)觀(guān)測(cè)蚯蚓生理行為指標(biāo)的變化來(lái)評(píng)價(jià)污染物對(duì)生態(tài)環(huán)境的毒害程度。

4 蚯蚓微觀(guān)指標(biāo)對(duì)污染物的響應(yīng)

外源污染物對(duì)蚯蚓微觀(guān)指標(biāo)的影響是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，由于污染物生物有效性會(huì)隨土壤性質(zhì)變化而變化，而生物對(duì)污染物產(chǎn)生的生理、生化反應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定。因此，利用生物的生理、生化反應(yīng)可以指示污染物在個(gè)體水平上對(duì)生物的危害，本文主要介紹下面4種微觀(guān)指標(biāo)對(duì)污染物的響應(yīng)。

4.1 蚯蚓體內(nèi)酶對(duì)污染物的響應(yīng)

污染物對(duì)蚯蚓酶影響的研究主要集中在重金屬對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響方面，抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)重金屬較為敏感，其活性變化可以很好地反應(yīng)重金屬的存在狀況。王輝等[23]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)酶活性與重金屬含量及處理時(shí)間關(guān)系密切，當(dāng)重金屬脅迫作用較低時(shí)，酶活性會(huì)因重金屬脅迫上升，但是重金屬脅迫過(guò)強(qiáng)，會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用。可以將抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)環(huán)境污染物的脅迫反應(yīng)用以指示污染物對(duì)環(huán)境的毒性效應(yīng)。

4.2 蚯蚓DNA對(duì)污染物的響應(yīng)

DNA作為生物體最重要的遺傳物質(zhì)，其穩(wěn)定性至關(guān)重要，DNA具有一定的自我修復(fù)能力，但是當(dāng)外界對(duì)DNA傷害過(guò)大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，影響其結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響生物生存生長(zhǎng)狀況[24]。有研究發(fā)現(xiàn)[25]，鄰苯二甲酸二乙酯會(huì)導(dǎo)致蚯蚓DNA損傷。王作彬[26]發(fā)現(xiàn)，殺蟲(chóng)劑作用導(dǎo)致蚯蚓體腔細(xì)胞DNA受到損傷，且DNA損傷程度與殺蟲(chóng)劑濃度間存在明顯的“濃度—效應(yīng)”關(guān)系。

4.3 蚯蚓溶酶體膜對(duì)污染物的響應(yīng)

溶酶體主要存在于蚯蚓體腔細(xì)胞內(nèi)，而中性紅染料可以在其中積累富集，一旦溶酶體膜受到損害，中性紅就會(huì)滲透到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致細(xì)胞變色。因此，可以用中性紅染料保留時(shí)間來(lái)表征溶酶體膜穩(wěn)定性[27]。武道吉等[28]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蚯蚓受到砷污染時(shí)，其溶酶體膜穩(wěn)定性下降，且溶酶體膜損害程度與砷濃度呈很好的線(xiàn)性關(guān)系。故而可用溶酶體膜穩(wěn)定性來(lái)表征污染物毒性效應(yīng)。

4.4 金屬硫蛋白對(duì)污染物的響應(yīng)

金屬硫蛋白(MTs)是細(xì)胞內(nèi)低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)。在真核生物中普遍存在的金屬硫蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，能提供強(qiáng)大的金屬結(jié)合和氧化還原能力，保護(hù)生物體免受有毒金屬的危害[29]。李超民等[30]研究表明，重金屬脅迫會(huì)使蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白含量顯著增加，但是重金屬濃度過(guò)高，會(huì)降低金屬硫蛋白的含量。

5 展望

蚯蚓作為“生態(tài)系統(tǒng)工程師”，其在生態(tài)毒理試驗(yàn)中的應(yīng)用對(duì)改良土壤污染、指示土壤污染狀況、揭示污染物作用機(jī)理等方面具有重要意義。目前，土壤污染問(wèn)題愈加嚴(yán)重，污染物更加復(fù)雜，著重于污染物的復(fù)合污染，遷移、污染物累計(jì)動(dòng)態(tài)過(guò)程等研究對(duì)于土壤污染的緩解有重大意義。同時(shí)，重點(diǎn)挖掘蚯蚓生物標(biāo)志物對(duì)土壤污染的早期預(yù)警作用，蚯蚓對(duì)污染土壤的改良作用也將為緩解土壤污染情況貢獻(xiàn)力量。