高毒力肺炎克雷伯菌感染的臨床及分子生物學特性①

李 政，何松哲，洪 鑄，趙 麗，楊 秋

(桂林醫學院附屬醫院檢驗科，廣西 桂林 541001)

肺炎克雷伯菌是條件致病菌，常引起醫院感染。1986年中國臺灣首次報道了肺炎克雷伯菌感染導致肝膿腫合并感染性眼內炎[1]，引起了臨床的廣泛關注。進一步研究表明其毒力明顯高于經典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella Pneumonia，cKP)，其不僅能引起醫院獲得性感染，亦能導致年輕健康個體致病，并且發病率和病死率非常高[2]，感染后常常發生遠處轉移和擴散，如眼內炎、腦膜炎和壞死性筋膜炎[3]。

近年來，歐洲、美洲、澳洲等許多國家對高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella Pneumonia，hvKP)方面的研究報道較多，而國內的報道相對較少。筆者探究肺炎克雷伯菌血流感染患者的臨床及菌株的特征，為臨床預防及控制hvKP感染提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集 2019年1月至2019年12月從患者血培養分離出來的肺炎克雷伯菌，剔除重復菌株。依據患者的病案號查詢并收集其年齡、性別、基礎疾病以及侵入性操作等資料。納入標準：患者出現臨床感染癥狀并且血培養分離出肺炎克雷伯菌。當患者在入院48 h內血培養出肺炎克雷伯菌時定義為社區獲得性感染，而患者的血流肺炎克雷伯菌感染發生在入院后48 h以上或患者接受過侵入性治療時定義為院內獲得性感染。

1.2 儀器與試劑

BacT/Alert 3D血培養儀(美國 BioMerieux.INC)，VITEK 2Compact全自動細菌鑒定和藥敏試驗系統(美國 BioMerieux.INC)，全自動快速微生物質譜檢測系統VITEK MS(法國BioMerieux.SA)，PCR儀(美國ABI公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(上海Bioshine公司)，DNA提取試劑盒(天根生物試劑有限公司)，PCR試劑及DNA marker購買于南京諾唯贊公司，相關擴增引物由上海生工合成。

1.3 檢測方法

1.3.1 菌株鑒定與藥物敏感試驗 細菌鑒定方法采用全自動快速微生物質譜檢測系統VITEK MS，藥物敏感試驗采用VITEK 2 Compact系統檢測，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603，均購于衛生部臨床檢驗中心。亞胺培南和美羅培南MIC值采用紙片法進一步確認，解釋標準參照2018版美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)規定的標準。

1.3.2 拉絲試驗 用細菌接種環挑取血平板過夜培養的菌落，如挑起黏液絲長度≥5 mm，則判為拉絲試驗陽性；如不能挑起黏液絲或黏液絲長度<5 mm判為陰性[4]。

1.3.3 DNA提取及多位點序列分析(MLST) 用DNA提取試劑盒提取菌株DNA，根據肺炎克雷伯菌的DNA序列設計引物，擴增7對管家基因(rpoB、gapA、mdh、Pgi、phoE、infB、tonB)，隨后進行測序并分析。根據MLST數據庫確定等位基因及ST型(www.pasteur.fr/mlst/Kpneumonia.html)。

1.3.4 莢膜血清型和rmp A基因檢測 根據文獻[5-6]合成引物，檢測常見莢膜型K1、K2、K5、K20、K54、K57和rmp A基因。引物序列見表1。

表1 莢膜表型相關基因和rmpA基因的引物序列

1.4 統計學方法

采用WHONET 5.6軟件分析藥敏結果，采用SPSS 17.0軟件進行數據分析。高毒力和經典肺炎克雷伯菌藥物敏感率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高毒力肺炎克雷伯菌的檢出率

130株肺炎克雷伯菌中，拉絲試驗陽性的高毒力肺炎克雷伯菌占29.23%(38/130)。

2.2 多位點序列分析(MLST)分型

MLST分型主要的流行株是ST23(30/130，23.08%)，其次為ST11(18/130，13.85%)、ST15(8/130，6.15%)、ST65(8/130，6.15%)，這4種ST型共占分離株的49.23%(64/130)。ST分型與不同血清型呈現一定的相關性。K1血清型主要以ST23型為主，K2血清型主要以ST65型為主。

2.3 血清型與rmpA基因的關系

拉絲試驗陽性的菌株rmpA基因檢測均為陽性，但有12株rmpA陽性的菌株拉絲試驗是陰性。其中2株rmpA和拉絲試驗陽性的菌株不屬于目標檢測的高毒力株血清型K1、K2、K5、K20、K54和K57型。在hvKP菌株中，高毒力莢膜血清型檢出率為94.7%(36/38)，分別為 Kl型26株占68.4%、K2型4株占10.5%、K57型4株占10.5%和K20型2株占5.3%。其他2株不屬于所檢測的6個型別中的任何一型，未檢出K5、K54血清型。見表2。

表2 130株肺炎克雷伯菌的分子生物特性

2.4 臨床分布

130株肺炎克雷伯菌中，38(29.2%)株為hvKP，92(70.8%)株為cKP；38例 hvKP感染患者中，30例為醫院獲得性感染，8例為社區獲得性感染，醫院感染中常伴有多種基礎疾病和誘發因素，基礎疾病中以肝膽疾病為多發，誘發因素中以外科手術等侵襲性操作為主，38例hvKP感染患者中有33例好轉出院，有3例(7.89%)死于感染性休克造成的多臟器衰竭。見表3。

表3 130株肺炎克雷伯菌的分布

2.5 抗生素敏感性試驗

高毒力肺炎克雷伯菌對試驗藥物敏感性明顯高于經典肺炎克雷伯菌，41.54%(54/130)分離株產ESBLs。其中經典肺炎克雷伯菌產ESBLs的比例是53.26%(49/92)，而高毒力肺炎克雷伯菌產ESBLs的比例是13.16%(5/38)(χ2=17.809，P<0.01)。見表4。

表4 hvKP與cKP對藥物敏感性分析

3 討論

高毒力肺炎克雷伯菌引起的感染性疾病主要出現在亞洲人群中[7]，可能與宿主的易感性和地域病原體暴露水平有關。筆者的研究中高毒力肺炎克雷伯菌檢出38株，檢出率29.2%。

肺炎克雷伯菌的莢膜是主要的毒力因子，可以抵抗或者逃避宿主的免疫殺傷作用。根據莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯菌分為78個K血清型，一些血清型包括：K1、K2、K5、K20、K54和K57被認為是與高毒力肺炎克雷伯菌相關，其中，K1和K2莢膜血清型與hvKP密切相關[8-9]。本研究共檢出K1、K2、K20和K57等4種高毒力的血清型，沒有檢測到K5或K54，與黎斌斌[10]的報道基本一致。本研究中筆者發現K1血清型不僅與社區獲得性肝膿腫密切相關，同時亦與原發菌血癥相關。研究還發現，免疫正常的患者中高毒力株肺炎克雷伯菌可引起嚴重感染，有的肝膿腫患者沒有任何基礎疾病。

本研究中4位60歲以下無任何基礎疾病的男性肝膿腫患者，其菌株均為ST23K1血清型，推測可能是克隆相關感染。魏丹丹[11]研究表明，hvKP的MLST分型多為ST23，而產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(carbapenemase resistant Klebsiella pneumonia，CRKP)多為ST11型。本研究中38例hvKP的MLST分型中，ST23占26例，雖檢出1例ST11，但其耐藥表型未發現對碳青霉烯酶耐藥，可能原因是該菌株產酶量低或者非產酶株。

高毒力肺炎克雷伯菌所致感染包括腹部疾病(社區獲得性肝膿腫、脾膿腫、自發性細菌性腹膜炎)、眼內炎、中樞神經系統疾病(腦膜炎)、胸部疾病(肺炎、膿胸)、骨骼肌與軟組織感染、尿道感染、混合感染、菌血癥，其中最常見的是社區獲得性肝膿腫。本研究顯示，21.1%(8/38)高毒力肺炎克雷菌感染的患者其原發灶來自肝膿腫，患有肝臟相關基礎疾病的患者是高毒力肺炎克雷伯菌的主要危險因素。但近年來，由產碳青霉烯酶高毒力肺炎克雷伯菌(carbap-enemase producing hypervirulent Klebsiella pneumonia，CP-hvKP)引起醫院感染的散發或者聚集性案例逐漸增多[12]。因此，對于此類細菌引起的感染應當引起醫護人員足夠的重視。

肺炎克雷伯菌血流感染時，易隨血流播散至其他部位形成感染，若為高黏液表型的菌株，由于毒力強，可導致嚴重的侵襲性感染，如眼內炎，腦膜炎等。因此，為了及早引起臨床醫師的關注，加強對患者的治療，控制嚴重侵襲性感染的發生，建議臨床微生物實驗室不僅要開展肺炎克雷伯菌藥物敏感性檢測，還有必要檢測肺炎克雷伯菌的黏液性狀表型、血清莢膜型和毒力基因，并及時將檢測結果與臨床溝通。

目前，世界范圍內高毒力肺炎克雷伯菌對抗生素耐藥還非常罕見(除了對氨芐西林天然耐藥)，本研究中高毒力肺炎克雷伯菌對藥物敏感性明顯高于經典肺炎克雷伯菌，但也發現了5株產ESBLs高毒力肺炎克雷伯菌。多藥耐藥的肺炎克雷伯菌感染成為抗感染治療的嚴重問題，產碳青烯酶(KPC)菌株也在逐年增加。高毒力肺炎克雷伯菌通過質粒獲取耐藥基因后可能成為高毒力高耐藥菌，應引起臨床高度重視。