豬冷凍精液品質影響因素分析

張樹山，韓雪峻，姜紅菊，張德福*

（1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2.上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海種豬工程技術研究中心，上海 2013021）

近五年來，在豬精液冷凍保存技術飛速發展、國家政策及非洲豬瘟等幾大因素合力推動下，依托大、中型種豬生產企業的冷凍精液商業化生產平臺、銷售及技術支持等完整產業鏈已初具規模，市場發展前景廣闊。豬冷凍精液（簡稱“凍精”）能突破時空限制，使種豬生產企業能快捷地為客戶提供優質凍精和售后技術支持，在提高引種效率和豬場生物安全性等方面意義尤為重大。眾所周知，豬凍精的品質主要受精子耐凍性、冷凍稀釋液以及凍精制作過程（包括精液采集、稀釋、降溫平衡、冷凍和解凍等）操作等因素影響，其品質是眾多因素的合力的結果。文章就豬凍精制作涉及影響因素作一梳理，目的在于拋磚引玉、為從事豬精液冷凍保存技術研究及凍精商業化生產的同行提供一些參考。

1 公豬精液采集環節

1.1 公豬精子耐凍性

與其他畜種的精子相比，豬精子耐凍性的個體差異性更為顯著。一個公豬站在規模化生產凍精前，一般要對所有公豬的精液進行冷凍試驗（即精子耐凍性篩選），解凍后精子活力、頂體完整性和畸形率等指標達到標準的公豬可用于凍精生產。具有高育種價值的種公豬可降低篩選標準。

1.2 公豬采集精液品質

采精場地應該注意衛生、消毒，有條件的公豬站也可采用自動采精系統代替傳統的采精方式，通過自動采精系統可以大幅度地降低精液中細菌含量。采精人員要嚴格遵守操作規范，只收集射精中第2段富含精子的乳白色精液。豬精液品質受季節、年齡和個體健康等因素影響，而原精品質是直接影響凍精制作成功與否的決定性因素之一。故技術人員必需重視原精的精液品質指標檢測，還要注意觀察精液顏色、氣味、膠狀物等是否正常，并作好記錄。對有炎癥以及老齡的公豬應該及時治療或淘汰。

1.3 精液采集與預稀釋

豬精液采集后應盡快檢測原精液的密度和活力，并以預稀釋液等溫做1∶1稀釋。在不同公豬站，原精送抵實驗室的實時溫度由運送時間和保溫裝置決定。在條件穩定的情況下，技術人員應通過多次測定精液運抵實驗室的溫度，參照該溫度來設置水浴溫度，從而能提前備好等溫預稀釋液，該溫度可能隨季節有所變化。

1.4 精子的預篩選

死亡精子會釋放出H2O2，死亡精子數量的增多可加劇活精子遭受的氧化損傷程度，發生凋亡的精子受精能力也會大大降低甚至喪失。除把控好精液品質檢測外，將精液中死亡或發生凋亡的精子去掉，對提高豬精液冷凍效果尤為重要。盡管關于精子篩選的相關研究起步較早，但大多方法要么適用于體外受精操作前的小體積精液處理，要么成本較高，如梯度離心法（如Pecoll法）和免疫磁珠法等。近幾年瑞典研究人員研發出一種單層離心方法（Single Layer Centrifugation，SLC），被認為是一種適用大體積精液且效果較好的一種高品質精子篩選方法。然而，尚未查到該產品的具體上市信息。

2 降溫平衡環節

2.1 降溫平衡條件

精液采集、運抵實驗室后，豬精液的降溫平衡包括的室溫、17 ℃和4 ℃ 3個階段。與其他家畜精子相比，豬精子對外界溫度變化更為敏感，溫度的快速下降、波動和17 ℃平衡階段溫度低于15 ℃，都會對豬精子產生不利影響和“低溫打擊”。室溫階段：豬精液采集后立即送往實驗室，一般將精液瓶/袋用毛巾作簡單包裹、室溫下靜置1 h左右；17℃階段：該階段降溫平衡被認為能增加豬精子的抗“低溫打擊”能力。除采用多層紗布或棉絮包裹外，也有采用水浴降溫，即將精液瓶/袋沒入與精液等溫的水中，通過加冰塊或逐步減少水量來提高降溫速度。水浴箱要放置溫度計并注意能實時觀察降溫情況（箱內水量越大降溫速率越小），注意盡量排出精液瓶/袋中的空氣并密封好，尤其注意精液溫度不能低于15 ℃以下。4 ℃階段降溫平衡方法同17 ℃階段。目前，已有可精確控制降溫速率的降溫平衡柜（如北京田園奧瑞生產的“程序控溫平衡儀”）問世，將精液瓶/袋移至柜中，就能以一定的降溫速率從精液溫度平緩降溫至目的溫度，操作方便、尤其適用于凍精的規模化生產。

2.2 離心濃縮及兩次稀釋操作

17 ℃降溫平衡結束后，即進行離心濃縮、等溫添加含有雞蛋卵黃的冷凍稀釋液（Ⅰ液）。豬精液具有體積大、精子密度小的特點，必需通過離心（800× g，10 ～ 25 min，17 ℃）才能實現冷凍保存。但離心操作會導致部分精子因位于沉淀下部、緊貼離心瓶底而產生損傷。有人采用在離心時在離心瓶底部加入1～2 mL市售液體試劑（也稱“緩沖墊”）的方法，可避免精子沉淀黏附在離心瓶底、減輕離心對精子的損傷程度，并能延長精液的離心時間、能有效避免離心后部分活力較好精子上浮至上清液，從而造成的精子損失。

4 ℃降溫平衡后，等溫添加含有冷凍保護劑的冷凍稀釋液（Ⅱ液）。

冷凍稀釋液Ⅰ、Ⅱ液應分別與降溫平衡的精液置于同一處，確保等溫稀釋。稀釋前，應分別將精液和冷凍稀釋液上下顛倒、充分混勻；加入冷凍稀釋液體積較大時，應分步稀釋（即先加入部分稀釋液混勻后再加入剩余部分、混勻）。

2.3 冷凍稀釋液因素

在整個降溫平衡和冷凍-解凍過程中，冷凍稀釋液的因素不容忽略。其功能是為精子提供一個適宜的pH與滲透壓和較低細菌數量的環境，且能為精子提供能量、增強其抗冷休克和抗冷凍損傷能力。

配制冷凍稀釋液應注意：1）配制和分裝稀釋液的用具必須刷洗干凈并進行嚴格消毒。2）試劑應該選擇分析純或化學純，根據配方精確稱量，配制稀釋液最好使用pH 7.0左右的蒸餾水。3）卵黃要取自新鮮雞蛋，不能混入蛋清或卵黃膜等雜物。4）配制好溶液后應檢測pH和滲透壓（如有條件）并調節至配方要求值。配制好溶液的pH偏差太大，說明溶液配制極有可能出現了失誤，應重新配制。5）預稀釋液、基礎稀釋液和解凍液等溶液配制好后要進行過濾（0.25 μm）或高壓滅菌。抗生素、卵黃和酶類等成分，應在溶液消毒冷卻后添加，或臨使用前添加并充分攪拌。6）溶液配制好后應該密封并冷藏保存，1周內使用。

市售豬凍精稀釋粉套裝則對操作人員要求相對較低、使用方便，但成本高一些。配制冷凍稀釋液時要嚴格根據說明書的提示進行。

3 冷凍降溫環節

3.1 精液灌裝、封口和裝架

添加冷凍稀釋液Ⅱ液后，即在低溫條件（4℃）進行灌裝、封口和裝架等操作。在操作過程中，程控低溫柜（成本高）或改造冰柜（結合控溫器，成本較低）可能溫度會上升，可采用放置冰塊或盛有液氮的泡沫盒，并通過觀察程控低溫柜（改造冰柜）不同位置溫度計及時調節溫度。

3.2 冷凍降溫操作

提前將程控冷凍儀打開，執行程序。將冷凍料架標記并碼好，快速將其移至程控冷凍儀中，蓋好即開始冷凍降溫。程控冷凍儀應與程控低溫柜（或改造冰柜）相鄰，盡量減少冷凍料架移動距離，二者位置或高度等應根據技術人員喜好作調整。技術人員應該佩帶護目鏡、手套、防護圍裙和套袖。冷凍降溫結束后，依照冷凍料架標記，并將冷凍細管快速分別移至倒有液氮的泡沫盒中。啟動精子程序冷凍儀加熱程序，用于去除箱體中水蒸汽。

冷凍細管收集操作過程中，應注意冷凍細管和布袋均保持在液氮面以下操作。

3.3 設備的維護

與牛、羊等家畜相比，盡管使用離心濃縮方法，裝管前，一般每頭份豬精液仍可達幾十毫升，多的可達100 mL以上。以0.5 mL細管為例，多頭份精液的灌裝、封口和打印等采用人工操作其勞動量極大，故加強相關設備定期保養、保持其正常運行對凍精的規模化生產非常重要。如：進行精液灌裝、封口操作時，要注意儀器聲音是否異常、打印機墨水余量（實驗室要有備貨以便及時添加）；低溫操作柜在使用結束后，可以在其中放置電風扇減少灌裝、封口和打印儀器內外水蒸汽，最后將小型移動式紫外燈置于低溫操作柜內定時消毒。冷凍儀在冷凍降溫程序結束后，要及時開啟加熱程序來減少其冷凍箱體內水分；此外，尤其在南方炎熱地區，當冷凍儀與液氮罐之間連接管斷開后，一些昆蟲類（如蟑螂）可能會通過連接管的開口端進入到程控冷凍儀中，甚至能到達液氮噴嘴部位，可能會降低液氮噴速或堵塞。故當冷凍儀與液氮罐之間連接管斷開后，應對連接管的開口端作密封處理。

4 技術人員因素

毛主席在《論持久戰》中指出，決定勝負的因素是人不是物。在影響凍精品質的眾多因素中，技術人員是凍精制作的最重要影響因素之一，幾乎能影響到凍精制作的所有環節。 第一，要求技術人員有“干一行、愛一行、專一行”的工作態度和敬業精神，尤其要有忍耐寂寞的能力，才能在較封閉的種公豬站內能保持不急不燥的工作態度。第二，凍精制作過程中，溶液配制、稀釋操作和降溫平衡等操作均需要規范的操作技能和嚴謹的態度。故要加強對技術人員的培訓、樹立生物安全意識和認真的工作態度，善于學習并能從工作中發現并解決問題。第三，凍精整個制作流程至少需要2～3人默契配合，出現問題需要團隊成員能各抒己見地提出自己觀點、形成解決方案并執行。這就要求團隊負責人能通過團隊共同的、切實可行的愿景、制定完善的規章制度及營造相互信任的組織氛圍等手段來建立一個高效、團結的團隊，與團隊每一位成員的努力是分不開的。

5 小結

豬凍精的商業化生產和應用已開始步入快車道，商品化凍精在優秀種公豬遺傳資源突破時空限制、提高生物安全性等方面已顯現出革命性推動養豬業飛速發展的先兆。當前，擺在凍精商業化生產者面前一個重要問題就是，如何利用現有成熟的豬凍精生產技術，依托日趨高效、完善的設備生產出高品質的凍精。依據“木桶效應”原理，整個凍精制作流程中每一個環節或影響因素都是“木桶”（即凍精品質）的一塊木板，其重要性都不容小覷。故凍精生產管理者和技術人員應逐步理順決定凍精品質的環節和因素，以系統工程理論指導，注重細節、從小處著手規范操作和針對影響因素對凍精制作流程逐步完善，通過積量變為質變提高豬凍精品質以及推動豬凍精技術更上一層樓！

參考文獻（略）