淺談豬精液保存在人工授精中的發展與展望

王利娟，常 棖

（北京農學院 動物科學技術學院，北京 102206）

人工授精是世界范圍內應用最廣泛、最有效的生豬繁殖技術。豬人工授精技術在我國養豬業已經取得了很高的效率，對豬品種改良和選育做出了巨大貢獻。盡管豬冷凍精液技術取得了重大進展，但液體保存仍然是廣大豬場豬精子保存的主要方法。而在激烈的市場競爭中，人們希望通過提高精液保存的質量來進一步提高育種效率。文章簡要回顧了過去和現在世界范圍內豬液態精液和冷凍精液保存、應用的情況，并對非洲豬瘟下改進豬精液保存技術助力生豬生產提出了建議。

1 發展情況

在全球的動物生產繁殖領域中，人工授精技術應用十分廣泛，取得了極為可觀的成績。該技術的應用，使得優質種公畜的配種率和利用率均得到了大幅提高，加速了優質家畜的改良進程，并且還克服了公母畜因為身體素質、偏好、生殖器官異常等造成的配種困難，提高了生產繁育的安全性，減少了疾病的傳播；而且可以減少飼養種公畜所需要的場地、飼料、和勞動力等飼養成本。人工授精技術最先應用到牛的生產繁殖中，而真正應用到豬的生產中比牛要晚得多。在20世紀初期，來自俄羅斯的科研人員就嘗試進行對豬的人工輸精，這是有報道以來世界上第一次將該技術運用到豬身上。豬人工授精技術在1932年首次試驗成功，后來該技術在許多國家中運用；隨著技術的進步，日本和英國等幾個國家率先實現了將豬人工授精達到了實用水平。我國的豬人工授精技術推廣應用在20世紀50年代開始試行，隨著我國生豬養殖規模的擴大，該技術在20世紀70年代末開始得到了突飛猛進的發展，而后在全國得到了普及推廣，進一步提高了我國生豬生產的存欄量與良種質量。而在國際方面，自從20世紀80年代人工授精獲得技術革新后，人工授精技術在極短的時間內迅速普及到歐美多個發達國家中。目前，在歐美等發達國家及中國等主要的豬肉生產國中，人工授精技術在生豬繁殖的普及率在90% 以上。而豬精液保存水平的提高，是提高人工授精技術的首要環節，可以極大地提高公豬精液使用的時間性和地域性。

在20世紀30年代的前蘇聯，科學家率先進行了使用豬新鮮精液進行人工輸精的試驗并成功地產下仔豬，這是液態精液在豬人工授精成功使用的最早的報道。因為液態儲存法保存的精子呈現活力活性高、授精成功率較高且操作快捷方便等優點，因此，液態保存的精液得到了了人們廣泛的傳播與應用，隨后人們對于豬液態精液的保存技術研究更加精準，推動了該技術飛速發展。據有關數據表明，目前全世界每年都有將近1 000萬頭母豬利用人工授精來繁育仔豬，而其中絕大多數使用的是液態保存的精液，它們的受胎率均在75%~90%之間。隨著現代交通運輸業的不斷發展，液態保存精液的高效便利與相對較低的成本等優點已經凸顯出來，而這些優點是冷凍精液無法比擬的。豬液態精液應用于人工授精已經成為生豬生產的主要方式，在提高種公豬的利用效率，推動豬人工授精技術的發展中具有重大意義。

在20世紀50年代及以后，冷凍精液的使用在養牛業中取得了巨大成功，極大地激起了養豬業應用該技術的需求。因為豬精子在耐凍性上與其他家畜相比有著明顯的個體差異，到20世紀70年代中期冷凍豬精液并沒有直接被用于實際生產之中，而是在后來不斷地技術創造革新發展后才被成功引進生產中。由于精液冷凍方法繁瑣，冷凍精液活力、受胎率和產仔數等性能指標不理想，導致冷凍精液在商業應用中進展緩慢。近幾十年來，美國及歐洲一些國家的豬精液冷凍技術迅速發展，其豬精液冷凍后的質量與牛相比已經非常接近了。但因豬冷凍精液的技術目前主要還是參照于牛冷凍精液的技術流程，且尚未有明確的針對豬精子的特性的冷凍程序及方法，目前的豬冷凍精液仍然存在凍融后活力下降，部分精子冷凍損傷，精子輸送效率降低，在生殖道存活時間短等問題，加上冷凍程序繁瑣，成本昂貴的因素，在豬場凍精的普及率上遠遠不如液態精液。對此國內外研究者開展了大量關于提高豬冷凍精液質量的研究，并取得了積極進展，比如通過向冷凍稀釋液中添加某些物質用來提高豬精子冷凍-解凍后的質量。

2 應用

2.1 人工輸精的進步

過去10年中，隨著集約化生豬養殖場的不斷發展，世界上主要的豬肉生產國中，豬人工授精的應用比例達到了90% 以上。在豬人工授精使用的傳統方法是子宮頸輸精法（CAI），即在豬子宮頸第2~3褶皺部位輸入稀釋好的精液，劑量一般是每次至少30億個精子。而最新的豬子宮深部輸精法(PCAI)，則是在將常規輸精管插入子宮頸皺褶后，再插入比常規輸精管長0.15～0.2 m的輸精內管，由于其長度較長，形狀較細，材質較軟，因此它可以通過子宮頸皺褶進入子宮體，達到更加精準高效的輸精效果。根據研究表明PCAI可直接將精液輸送到子宮體，避免了精液滯留在子宮頸皺褶處，可以減少精液的使用量，大大減少了精液的浪費，其精液劑量只需要保證每份精液中精子總數在10億個精子以上，即可達到與CAI相同的效果。近年來有實驗室報道已將PCAI精子使用數降至5億個也可達到相似效果?？梢姂肞CAI技術，養豬生產者可以使優質公豬的精液對更多的母豬進行人工授精，極大地降低了優質精子采購成本，提高了精子的利用率。但該技術目前也存在一些缺點，就是在后備母豬上操作難度大，輸精管價格昂貴增加成本，而且如果操作不當會給母豬帶來損傷，所以PCAI技術的應用仍然具有挑戰性。而在公豬精液價格相對較低的國家和地區，PCAI似乎不太有吸引力。

2.2 性別分類控制技術

動物的性別分類控制技術是通過人為干預動物的正常生殖過程，使成年雌性動物產出人們期望性別后代的一門生物技術。性別控制技術在畜牧生產中有著重大的意義。通過控制后代的性別比例，可充分發揮受性別限制和影響的生產性狀(如泌乳、生長速度、肉質等)的最大經濟效益。目前性別分類技術在奶牛養殖業中的發展較為成熟，但是其在養豬業中的應用還不夠全面。其實早在1991年，Johnson就報告了首例的豬精液性別分類方法，隨后該技術進行了改進，篩選儀器、軟件和精子分揀速度都有了進一步的發展，使其更適用于低劑量豬人工授精，但因為豬特殊的解剖結構，仍然需要大量精子用于子宮頸內人工授精，增加了養殖成本，從而限制了豬性別分類精子在生豬生產中的應用。2006年由中國科學家主持研究的，世界首例通過分離x、y精子的性別控制技術進行人工授精而獲得的小水牛誕生。這種x、y精子分離技術被稱為貝爾茨維爾精子性別鑒定技術，而后性別控制技術結合人工授精開始廣泛應用于畜牧生產中。2009年中國首例性別控制豬在廣西誕生，其中運用的性別控制技術與牛類似，即利用x精子和y精子之間DNA含量的差異，先將精液染色，然后利用x精子與y精子在流式細胞儀中的熒光強度不同，將兩者分離，最后用于人工授精技術，向受體母豬中輸入分離得到的x精子或y精子。但是在實驗過程中，豬比牛更為困難，具體其原因有：1）有研究表明，豬的x和y精子之間DNA含量的差異小，只有3.6%，不容易分辨；2）豬精子在進行分離處理過程中極易受損，在分離過程中，精子會被稀釋、染色、擠壓、激光照射等處理，稍微有一點處理不當實驗就會失??；3）豬的人工授精需求量大，需要長時間進行分離。目前，精子按性別分類，其產生效率只有每小時20億～25億個精子，生產效率不高，而且在分離過程中會損失相當數量的精子，從而產生相對較高的生產成本，加之由于豬人工授精技術的限制，當養殖場在現有條件下使用性別分類精子時，生育能力和產仔數都會受到影響，因此性別控制技術批量應用于生豬生產仍有一段路要走。

一些機構已經對性別冷凍精液進行了研究，這仍然是一件棘手的問題，因為從精子的保存方面來看，冷凍豬精子解凍后活力不高，而對精子的篩選又會不可避免地造成部分精子的死亡，加之較昂貴的成本成為阻遏該項技術發展的重要原因。所以不斷優化性別篩選分類后豬精子的保存和使用技術，也是今后進一步的研究的方向。而對常規使用的豬精液冷凍保存技術的突破，可能會更好地促進保存性別分類精液的研究。

3 展望

在大多數豬肉生產國，保存的豬精液在人工授精中的應用已得到充分證實。隨著對豬精液的分析、處理、智能管理和網絡信息等新技術的創新發展，大大提高了具有良種優勢的豬精液利用效率。而與有效表型特征相關聯的DNA堿基選擇工具的出現為進一步提高人工授精的效率提供了幫助。然而全世界人工授精（AI）中僅有1% 是用冷凍解凍的豬精子進行的，雖然冷凍儲存的方法幫助了豬精子庫的建立，并且可以保存遺傳物質幾十年。但有報告顯示，將精子在液氮中進行長期儲存會影響解凍后精子的質量。而冷凍保存程序造成的損害，會直接降低冷凍解凍的豬精子的受精能力和人工授精后的繁殖性能。這種低溫損傷主要是由于豬精子對冷休克和過氧化損傷的高度敏感性，因為在其質膜成分中含有很高的不飽和磷脂和低膽固醇。因此，冷凍-解凍程序會導致精子膜失穩，從而影響鈣均質酶、頂體完整性導致膜脂紊亂。但近年來豬冷凍保存技術有了飛速的進步，這些進步涉及冷凍保存程序之前的精子選擇、冷凍和解凍延長劑的添加劑、人工授精技術的相關性和受精-排卵間隔，相信隨著這些技術的進步能夠進一步解決豬精子冷凍帶來的損傷。在實際生產中，將科學研究與實際生產相結合是非常重要的，通過技術的進步引導產業的發展，將為我國恢復生豬生產提供良好的支撐。

對液體或冷凍狀態下將性別分類的精子引入人工授精實踐，也是為了實現生豬產業的復產擴繁這一目標。對豬來說，將精子進行性別分類后的活力與受精能力均低于直接進行人工授精的精子。但有實驗表明，在一定條件下使用低至5×107的精子數目，仍然可以生產出所需性別的仔豬，結合目前子宮頸深部授精技術已經取得了一些成功，需要進一步努力開發出更加適用于使用低精子數進行 PCAI的導管。在對照實驗中，使用特殊設計的導管可提高母豬的受孕率，減少對精子的浪費，提高利用率。而在這一研究領域的成功讓性別分類精液在養豬業中廣泛應用成為了可能。在K.Willenburg的報告中，總結了目前人們對豬的性別分類精液做出的努力，盡管之前相對較低的性別分類精子數限制了其在豬人工授精的應用，但隨著科技的進步這一情況正發生著積極地改善。科學家們認為，通過篩選出來的豬性別精子可以戰略性地應用于養豬業，以滿足對雄性和雌性豬的不同需求。目前正在研究利用其他生物技術的最新進展，來替代目前流式細胞術的方法，這包括通過微流控制設備對精子進行分類，以金納米顆粒為載體對單個精子進行序列特異性標記或基因編輯，以誘導SYR基因的敲除或干擾，并直接影響帶有Y染色體的精子的功能。

目前，非洲豬瘟的全球蔓延對生物安全提出了挑戰，對養豬業的發展造成了極大威脅。盡管疾病預防和檢測技術在當前的形勢下發揮了很大作用，但是抵抗關鍵病原體進入的全面保護機制，沒有辦法被充分保證。而引起母豬繁殖失敗或嚴重疾病的病毒，如豬藍耳病（PRRS）、豬流行性腹瀉（PED）或 非洲豬瘟（ASF），很可能會通過臨床上未確診的公豬精液傳播?，F在CRISPR/Cas9技術可用于產生抗PRRS等病毒的公豬。如果實驗用的公豬符合政府的規定，并且可以滿足消費者的需求，那么對它們經過基因工程處理，可以極大地提高養殖場的生產力。如果相關實驗人員使用紙質微流控設備和高速DNA擴增技術，對公豬精液進行多種病原體的快速現場診斷，那么其將成為性價比高、便于使用和有效預防豬病的最佳工具。隨著冷凍精液技術的發展，可以將檢測沒有病原體的精液進行冷凍保存，使用這種方式可以安全而高效地應用于生豬生產中。