同型半胱氨酸修飾甲基-CpG結(jié)合蛋白2與自閉癥譜系障礙相關(guān)

王曄陽(yáng) 趙健元

近年來(lái)，自閉癥譜系障礙(ASD)的發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)[1]。ASD的生物學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜。有研究報(bào)道，ASD患者的同型半胱氨酸(Hcy)水平在幼年和成年階段均顯著高于正常范圍[2, 3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，異常激活的甲硫氨酰-tRNA合成酶(MARS)將Hcy錯(cuò)誤編輯為高能同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯(HTL)，對(duì)相關(guān)蛋白形成N-Hcy修飾，從而使蛋白功能受到影響[4]。本文通過(guò)研究受N-Hcy修飾影響的蛋白及其功能改變，進(jìn)一步探討ASD的潛在發(fā)生機(jī)制。

1 方法

1.1 人體樣本來(lái)源 ASD患兒和對(duì)照組兒童外周血cDNA樣本來(lái)自本課題組前期研究[5]。

1.2 細(xì)胞株和動(dòng)物來(lái)源 人胚腎上皮細(xì)胞系HEK-293T和小鼠神經(jīng)干細(xì)胞NE-4C細(xì)胞系均來(lái)自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22來(lái)自中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)，野生型C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將NE-4C細(xì)胞用不同濃度梯度(0、0.25、0.50、1.00 mmol·L-1)Hcy處理25 h，抽提細(xì)胞RNA并行反轉(zhuǎn)錄(諾唯贊公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。以β-actin和GAPDH作為內(nèi)參，利用在線軟件PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)設(shè)計(jì)MARS、GRIN2A、BDNF、EAAT1～4基因的引物，用熒光定量PCR試劑盒(諾唯贊公司)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 串聯(lián)親和純化法 檢測(cè)MARS互作蛋白的TAP法參考本課題組前期研究[6]。

1.5 免疫沉淀 為檢測(cè)Hcy對(duì)MeCP2的修飾，將NE-4C細(xì)胞用4 mmol·L-1Hcy處理，收集細(xì)胞裂解液，加入碘乙酰胺保護(hù)巰基，取上清并與MeCP2抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab2828)和G蛋白孵育，沉淀后收集Hcy處理的MeCP2蛋白，一部分經(jīng)胰酶酶切、干燥后用于液相質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，一部分用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)MeCP2的Hcy修飾情況。Hcy修飾抗體為實(shí)驗(yàn)室自制[6]。

1.6 凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA) 為檢測(cè)Hcy修飾對(duì)MeCP2功能的影響，用帶羧基熒光素(FAM)標(biāo)簽的甲基化、非甲基化DNA和 MeCP2、HTL(0、1、4 mmol·L-1)互作，反應(yīng)后用于DNA印跡實(shí)驗(yàn)。……