骨肉瘤組織中賴氨酸羥化酶2 表達情況及與病情程度的相關性分析

念其錢

福州市第二醫院病理科，福建福州 350007

骨肉瘤又稱之為成骨肉瘤， 是從間質細胞系發展而來，發生后可出現疼痛、發熱、腫塊、跛行等癥狀，該病多發于兒童和青少年，惡性程度較高，對患者健康乃至生命安全造成嚴重威脅[1]。 目前臨床通過手術、放化療使骨肉瘤患者生存時間顯著增加， 但部分患者初診時就已經發生肺轉移，該類患者往往預后不良[2]。 準確評估骨肉瘤患者病情程度，為臨床治療提供可靠依據，是改善患者預后的關鍵。 近年來研究發現賴氨酸羥化酶2 在膠原纖維沉積和重構上有重要作用， 而骨肉瘤的發生與發展與膠原纖維的重構和沉積密切相關，故認為賴氨酸羥化酶2 與骨肉瘤侵襲、轉移有關，不過其在骨肉瘤組織中的表達情況及與病情程度的關系的相關報道尚少[3]。 該研究方便選擇2017 年8 月—2019 年11 月的47 例骨肉瘤患者就此展開分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇該院47 例骨肉瘤患者進行研究，該次研究經醫院倫理委員會批準。 47 例患者包括男性27 例，女性20 例，年齡10~41 歲，平均年齡（21.57±6.43）歲；腫瘤位于脛骨或股骨38 例，其他部位9 例;Enneking 分期為Ⅰ期6 例，ⅡA 期13 例，ⅡB 期16 例，Ⅲ期12 例；軟組織浸潤29 例，無軟組織浸潤18 例；骨肉瘤細胞淋巴結轉移14 例，未轉移33 例。 所有患者均取新鮮骨肉瘤腫瘤組織及癌旁正常組織為標本， 采集標本后快速放置于液氮中，并于-80℃環境下保存備用。 納入標準：①經手術病理確診為骨肉瘤；②術前未接受任何治療；③簽署知情同意書；④資料完整。 排除標準：①存在癌癥家族史；②合并其他系統性慢性疾病；③合并其他腫瘤性疾病；④合并其他影響檢測指標的疾病。

1.2 方法

采用Westem bolt 法對PLOD2 的表達進行檢測，以sh-PLOD2、sh-NC、LV-over/PLOD2、LV-vector 轉染U-2O S 細胞，常規進行24 h 培養，取蛋白裂解液加入，冰上裂解1 h。 在4℃環境下以12 000 r/min 的速度進行15 min 的離心處理，取上清液，采用蛋白質定量（BCA）分析試劑盒測定蛋白濃度后， 放置于-80℃環境下儲存備用。取30 μg 蛋白質在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以半干法轉移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h， 加入一抗4℃過夜， 以緩沖液（TBST）進行3 次洗膜。 加入二抗，于室溫下進行2 h 孵育，再次以TBST 進行3 次洗膜處理。 取化學發光顯色試劑加入，在暗室中拍攝X 線片顯影，進行圖像掃描，以β-actin 為內參照，使用凝膠圖像分析軟件對目標條帶的灰度值進行分析。重復進行3 次實驗。PLOD2 蛋白定位于細胞質呈棕褐色為陽性， 根據染色強度與陽性細胞百分比計算免疫組化染色得分， 得分1~4 分為低表達，＞4 分為高表達。 免疫組化染色及評分方法：石蠟切片常規烤片，并進行逐級脫蠟、脫水處理，經3%H2O2孵育以將內源性過氧化物酶活性消除， 然后置于10%山羊血清封閉， 加入一抗后于室溫進行1 h 的孵育，經PBS 沖洗后加入二抗，再于室溫進行15 min 的孵育，二氨基聯苯胺顯色后蘇木素復染，梯度乙醇脫水，在二甲苯透明之后封片，以PBS 替代一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標

觀察比較PLOD2 在骨肉瘤組織、 癌旁正常組織中的陽性表達情況， 同時比較不同Enneking 分期患者PLOD2 表達及骨肉瘤細胞有無淋巴結轉移患者、 軟組織有無浸潤患者PLOD2 表達情況，分析PLOD2 與骨肉瘤分期及是否轉移、軟組織浸潤的相關性。

1.4 統計方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料以頻數及百分比表示，組間差異比較以χ2檢驗，相關性分析采用Pearson 檢驗。 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PLOD2 陽性表達情況

PLOD2 在骨肉瘤組織中的陽性表達率為72.34%，在癌旁正常組織中的陽性表達率為6.38%，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同Enneking 分期患者PLOD2 表達顯示，Ⅰ~ⅡA 期的陽性表達率為52.63%，與ⅡB~Ⅲ期85.71%比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；骨肉瘤細胞轉移患者PLOD2 表達陽性率為92.86%，軟組織浸潤患者陽性表達率為75.86%，與未轉移、未發生軟組織浸潤比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PLOD2 陽性表達情況對比[n(%)]

2.2 Pearson 相關性分析

經Pearson 相關性分析顯示，PLOD2 與骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴結轉移、軟組織浸潤呈正相關性（r=0.698、0.663、0.711， P＜0.05）。

3 討論

骨肉瘤是多發于20 歲以下青少年或兒童的一種常見惡性腫瘤， 目前針對該病的治療尚無特效治療手段， 雖然諸多研究顯示輔助化療能夠促進患者預后改善，但疾病復發患者預后仍較差，因此探索新的治療方式促使骨肉瘤患者生存率有效提高意義重大[4]。 研究認為骨肉瘤的發病機制可能與生長因子、抑癌基因、染色體等因素有關，但對于骨肉瘤侵襲、轉移分子機制尚不明確， 臨床在使用抑制骨肉瘤細胞侵襲、 遷移的藥物時，缺乏判斷骨肉瘤病情程度變化的敏感生物標志物，因此針對該方面的研究是當前重點課題[5-6]。

PLOD2 是一種介導膠原賴氨酸羥化的酶， 相較于非羥化賴氨酸殘基， 羥化賴氨酸殘基能夠產生更強的膠原交聯穩定性，PLOD2 能夠通過膠原修飾及細胞外基質重塑介導低氧誘導的腫瘤轉移，其在腫瘤細胞、間質成纖維細胞中上調表達可改變膠原交聯腫瘤基質，促使膠原纖維形成，進而造成腫瘤細胞侵襲、遷徙[7-8]。有研究發現，PLOD2 高表達能夠促進膠原纖維交聯，使腫瘤病灶處的膠原纖維的沉積增加， 進而誘發癌細胞淋巴結轉移， 不過關于PLOD2 在骨肉瘤中表達情況的研究報道尚少[9-10]。 該研究結果顯示，PLOD2 在骨肉瘤組織中的陽性表達率明顯高于在癌旁正常組織中的陽性表達率，說明在骨肉瘤腫瘤組織中PLOD2 呈高表達，其在骨肉瘤診斷中具有重要作用。 PLOD2 是一種膠原蛋白修飾酶，而膠原蛋白類似于層粘蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白等，是一種細胞外基質蛋白，能夠對組織內穩態、 炎癥、 器官發育及癌癥等進行調節， 因此PLOD2 異常表達可對細胞外基質造成破壞， 促進細胞侵襲、遷移[10]。而且PLOD2 下游信號通路中的己糖激酶2、整合素A3 也可能對其表達產生影響，從而導致細胞內信號，引起腫瘤侵襲、轉移情況[11]。 樊李瀛等[12]研究中也認為骨肉瘤腫瘤組織中PLOD2 基因表達水平較癌旁正常組織明顯更高，這與該研究結果一致。 而且該研究結果顯示腫瘤分期與PLOD2 表達呈正相關，骨肉瘤細胞轉移、 軟組織浸潤患者的PLOD2 表達陽性率分別為79.03%、75.76%，明顯高于未轉移、未浸潤者，該研究結果中骨肉瘤Enneking 分期為Ⅰ~ⅡA 期的PLOD2 陽性表達率明顯低于ⅡB~Ⅲ期，骨肉瘤細胞轉移、軟組織浸潤患者的PLOD2 表達陽性率分別為92.86%、75.86%，明顯高于骨肉瘤細胞未轉移、軟組織未浸潤的患者，與上述研究結果大致相同，說明PLOD2 的表達隨著骨肉瘤患者病情程度的加重而增高。 該研究進行Pearson 相關性分析顯示，PLOD2 與骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴結轉移、軟組織浸潤呈正相關性，充分印證了上述研究結論。

綜上所述，PLOD2 在骨肉瘤組織中呈高表達，其陽性表達與骨肉瘤分期及轉移、軟組織浸潤呈正相關性，可作為臨床判斷病情進展及預后的指標。