腎素-血管緊張素系統雙軸對股骨頭缺血性壞死的影響

帥波 陳升浩 沈霖

[摘要] 目的 探討腎素-血管緊張素系統（RAS）雙軸對非創傷性股骨頭缺血性壞死（INFH）的影響。 方法 收集2015年10月—2017年6月于華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院及湖北省隨州市中心醫院骨科行股骨頭置換術的90例患者，其中45例INFH患者作為INFH組，45例創傷性股骨頸骨折術后患者作為對照組。術前檢測兩組患者循環血中的血管緊張素轉換酶（ACE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素Ⅱ-1受體（AT1R）、ACE2、Ang（1-7）、Mas受體（Mas-R）的表達情況，術后檢測股骨頭局部骨組織中的ACE、AngⅡ、AT1R、ACE2、Mas-R、破骨細胞分化因子（RANKL）及骨保護素（OPG）mRNA的表達情況，并進行免疫組化分析。 結果 兩組循環血中ACE、AngⅡ、AT1R、ACE2、Ang（1-7）及Mas-R表達情況比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。INFH組股骨頭局部骨組織ACE2、Mas-R、OPG mRNA表達水平均低于對照組（P < 0.05），而ACE、AngⅡ、AT1R、RANKL mRNA表達水平及RANKL mRNA/OPG mRNA均高于對照組（P < 0.05）。與對照組比較，INFH組骨組織HE染色顯示組織內脂肪細胞增生，骨小梁變細，骨細胞核固縮、深染，骨陷窩空虛明顯增多;INFH組骨組織Masson染色顯示深藍色變淺，較為雜亂，顯示膠原結構減少、纖維結構明顯增生。免疫組化結果提示INFH組骨組織中ACE及AT1R表達高于對照組，而ACE2及Mas-R表達低于對照組。兩組ACE、AT1R、ACE2及Mas-R四組分陽性表達面積百分比比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 RAS雙軸[ACE/AngⅡ/AT1R軸和ACE2/Ang（1-7）/MAS軸]在正常與INFH患者骨組織局部中表達差異，可能參與調節局部骨轉換及骨壞死的進程，為后續研究及診療提供新的思路。

[關鍵詞] 股骨頭缺血性壞死;非創傷性;腎素-血管緊張素系統;骨轉換

[中圖分類號] R681? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（b）-0004-06

[Abstract] Objective To investigate the influence of renin angiotensin （RAS） biaxial on patients with ischemic necrosis of the femoral head （INFH）. Methods From October 2015 to June 2017， 90 patients underwent femoral head replacement in the Department of Orthopedics in Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology and Suizhou Central Hospital in Hubei Province were selected. Among them， 45 patients with INFH were served as INFH group， and 45 patients with postoperative traumatic femoral neck fracture were served as control group. The expressions of angiotensin converting enzyme （ACE）， angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）， angiotensin Ⅱ-1 receptor （AT1R）， ACE2， Ang （1-7）， Mas receptor （Mas-R） in the circulating blood of two groups were detected before operation， and the expressions of ACE， AngⅡ， AT1R， ACE2， Mas-R， receptor activator of NF-κB ligand （RANKL） and osteoprotegerin （OPG） mRNA in local bone tissue of femoral head were detected after operation， and immunohistochemical analysis was performed. Results There were no significant differences in the expressions of ACE， AngⅡ， AT1R， ACE2， Ang（1-7） and Mas-R between two groups （P > 0.05）. The mRNA expression levels of ACE2， Mas-R and OPG in local bone tissue of femoral head in INFH group were lower than those in control group （P < 0.05）， while the mRNA expression levels of ACE， AngⅡ， AT1R， RANKL and RANKL mRNA/OPG mRNA were higher in INFH group than those in control group （P < 0.05）. Compared with control group， HE staining of bone tissue in INFH group showed hyperplasia of adipocytes， thinning of bone trabeculae， pyknosis and deep staining of bone nucleus， and obvious increase of empty bone lacunae; Masson staining of bone tissue in INFH group showed that dark blue became lighter and more disordered， showing the decrease of collagen structure and obvious hyperplasia of fibrous structure. The results of immunohistochemistry showed that the expressions of ACE and AT1R were higher in INFH group than those in control group， while the expressions of ACE2 and Mas-R were lower than those of control group. There were significant differences in the percentage of positive expression area of ACE， AT1R， ACE2 and Mas-R between two groups （P < 0.05）. Conclusion Some components of RAS biaxial in local bone tissue of INFH patients are abnormally expressed， which may be involved in the process of local bone turnover and osteonecrosis， providing new ideas for the follow-up study and diagnosis and treatment.

[Key words] Femoral head ischemic necrosis; Nontraumatic; Renin angiotensin system; Bone turnover

非創傷性股骨頭缺血性壞死（INFH）的發病機制可能與局部微循環障礙、局部無菌性炎癥反應、局部氧化應激反應、局部骨代謝異常等有關[1-4]。因此，醫學界對股骨頭局部微循環及骨代謝具有級聯效應的調節因子探討是尋求診治的關鍵點。有研究顯示，骨組織局部腎素-血管緊張素系統（RAS）經典軸血管緊張素轉換酶（ACE）/血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）/血管緊張素Ⅱ-1受體（AT1R）可對局部微循環[5]、局部炎癥反應[6]、局部氧化應激反應[7]及局部骨轉換的調節作用[8]產生影響。隨著研究的深入，ACE2/Ang（1-7）/Mas軸作為反向調節RAS的新支路成為研究熱點，Ang（1-7）與Mas受體（Mas-R）結合后可發揮血管舒張，并具有抗炎、抗氧化應激、抑制粥樣斑塊形成、抗血栓形成等作用。循環血及骨組織局部RAS雙軸[ACE/AngⅡ/AT1R軸和ACE2/Ang（1-7）/MAS軸]在INFH發生、發展中扮演的角色如何不得而知。故本研究欲初步探討RAS雙軸在正常與INFH患者循環血及股骨頭局部骨組織中的表達情況，推測RAS雙軸對INFH的影響，為后續研究及臨床診治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2017年6月于華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院及湖北省隨州市中心醫院骨科行股骨頭置換術的90例患者，其中45例INFH患者作為INFH組，45例創傷性股骨頸骨折術后患者作為對照組。記錄所有患者的一般情況，包括性別、年齡、體重指數（BMI）、血壓等資料。INFH組診斷標準及排除標準參照筆者前期臨床試驗[9]。本研究已經武漢協和醫院研究中心倫理委員會批準，所有參加本研究的受試者均表示同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 患者血清RAS雙軸各組分表達情況的檢測? 所有受試者均空腹抽取肘正中靜脈血，將采集的標本離心15 min（4℃，4000 r/min，離心半徑13.5 cm），并將分開的一部分標本保存于-70℃冰箱內備用，統一采用酶聯免疫吸附法測定患者血清ACE、AngⅡ、AT1R、ACE2、Ang（1-7）及Mas-R的表達情況。

1.2.2 骨組織局部RAS雙軸各組分及骨保護素（OPG）、破骨細胞分化因子（RANKL）mRNA的檢測? 總RNA抽提參考文獻[7]。反轉錄及定量PCR嚴格按試劑盒（FastStart Universal SYBR Green Master，Rox，Roche，Cat.No.04913914001）說明書操作，引物由Invitrogen Biotechnology Co.， LTD中國公司合成[10-11]，相關信息見表1。

1.2.3 骨組織HE、Masson染色及免疫組織化學檢測? HE、Masson染色參照試劑盒（美倫生物技術有限公司，MB9898、MA0123）說明書操作。ACE、AT1R、ACE2及Mas-R四個抗體一抗均屬于抗兔或鼠及抗人通用型抗體，均購于Abcam公司，編號分別為ab28311、ab18801、ab15348、ab236754。步驟依次為抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗、加酶標二抗、加顯色劑、復染、脫水、封片及鏡檢拍照：晾干的切片可以在顯微鏡下采集圖像并分析。數據分析：每組每次取8張切片，每張切片拍一張照片，MIQAS醫學圖象定量分析系統進行分析，以棕黃色染色為陽性表達，將10倍視野均分為3個區，記錄3個區內的陽性產物數目及總面積，分別算出3個區的陽性細胞數目比率（陽性細胞數/總面積），取其平均值為此標本的陽性細胞數的百分比。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據統計分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般情況比較

兩組性別、年齡、BMI、血壓比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 兩組患者循環血中ACE、AngⅡ、AT1R、ACE2、Ang（1-7）及Mas-R表達情況比較

兩組循環血中ACE、AngⅡ、AT1R、ACE2、Ang（1-7）及Mas-R表達情況比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.3 兩組患者股骨頭局部骨組織RAS組分及OPG、RANKL mRNA表達情況比較

INFH組股骨頭局部骨組織ACE2、Mas-R、OPG mRNA表達水平均低于對照組（P < 0.05），而ACE、AngⅡ、AT1R、RANKL mRNA及RANKL mRNA/OPG mRNA表達水平均高于對照組（P < 0.05）。見表4。

2.4 兩組患者股骨頭局部骨組織HE、Masson染色情況比較

兩組股骨頭局部骨組織HE、Masson染色分析：與對照組比較，INFH組骨組織HE染色顯示組織內脂肪細胞增生，骨小梁變細，骨細胞核固縮、深染，骨陷窩空虛明顯增多;INFH組骨組織Masson染色顯示深藍色變淺，較為雜亂，顯示膠原結構減少、纖維結構明顯增生。見圖1（封三）。

2.5 兩組患者股骨頭局部骨組織免疫組織化學檢測結果比較

兩組股骨頭局部骨組織免疫組織化學檢測結果：RAS雙軸相關組分和INFH密切相關，免疫組化結果提示INFH組骨組織中ACE及AT1R表達較對照組高，而ACE2及Mas-R表達水平低于較對照組。見圖2。兩組ACE、AT1R、ACE2及Mas-R四組分陽性表達面積百分比比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表5。

3 討論

經典的RAS是調控和維持機體內環境穩定的重要體液調節系統，包括腎素、腎素受體、ACE、血管緊張素原（AGT）、AngⅡ及其受體等。RAS雙軸對INFH的影響有待進一步證實。①RAS經典軸可能對INFH局部骨組織微循環的影響：組織細胞中的RAS激活產生的AngⅡ與其受體結合后產生強烈的縮血管作用[12]，可使骨組織局部微血管持續痙攣，使骨組織處于缺血、缺氧狀態，導致骨組織微循環障礙，進一步激活RAS，造成惡性循環。②促進炎癥反應：AngⅡ上調血管滲透因子基因表達，誘導巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6等致炎細胞因子，導致炎癥的級聯擴增，導致骨組織水腫、炎癥細胞浸潤和血管通透性增加[13-15]，可能加重INFH的進展。③介導氧化應激反應：AngⅡ與其AT1R結合，在細胞信息傳遞中激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶產生活性氧，促進細胞因子的活化并產生大量氧自由基，引起細胞壞死或凋亡[16]，可造成局部骨組織功能障礙甚至壞死。④調節骨代謝作用：AngⅡ可通過ERK信號通路誘導成骨細胞表達、分泌RANKL，上調RANKL/OPG比值，并促進其與表達于破骨前體細胞表面的RANK結合，同時，促使其分化為成熟有活性的破骨細胞，發揮骨吸收的作用，AngⅡ的作用可被其Ⅰ型受體拮抗劑奧美沙坦所阻斷[17]。體內外實驗證實AngⅡ還能提高成骨細胞分泌血管內皮生長因子（VEGF），從而促進破骨細胞的成熟、分化以及破骨細胞介導的骨吸收作用[18]。ACE2/Ang（1-7）/Mas新軸是近年來研究較熱的RAS另一重要分支，ACE2是新軸中的關鍵酶，主要催化AngⅡ轉化為Ang（1-7），ACE2的作用與ACE截然相反，是RAS中的負性調節因子，具有舒張血管、抗炎、保護血管內皮等作用[19-23]。

本研究結果顯示，循環血中RAS各組分水平在正常及INFH患者中無明顯差異，但INFH組患者股骨頭局部ACE2及Mas-R mRNA的表達水平明顯低于對照組（P < 0.05），而ACE、AngⅡ及AT1R mRNA的表達水平明顯高于對照組（P < 0.05）。究其原因可能為組織中的RAS的基因轉錄和表達，并不依賴于循環血中的腎素、ACE和AGT，而是一個自我調控的獨立系統，并且通過自分泌和旁分泌的方式對局部組織產生生物學作用[24]，故本研究得出骨組織局部RAS組分的差異表達。本研究還得出INFH患者股骨頭局部OPG mRNA的表達水平明顯低于對照組（P < 0.05），而RANKL mRNA的表達水平及RANKL mRNA/OPG mRNA比值明顯高于對照組（P < 0.05），且研究還發現，INFH患者股骨頭局部ACE2及Mas-R mRNA的表達水平明顯低于對照組（P < 0.05），而ACE、AngⅡ及AT1R mRNA的表達水平明顯高于對照組（P < 0.05）。RAS雙軸各組分的差異性表達與OPG mRNA、RANKL mRNA及RANKL mRNA/OPG mRNA比值是否存在一定的關聯仍不得而知。究其原因，主要是由于本臨床研究樣本量偏少及實驗難度較大（如未使用阻斷劑干預研究）等因素影響，尚不足以分析明確此問題，這也是本研究存在的缺陷之一。但結合前期及其他學者近期骨組織局部RAS與骨代謝的調控相關性的熱點研究，推測兩者之間可能存在一定的關系。如有學者的研究顯示，AngⅡ可通過上調成骨細胞表面的RANKL從而間接增強破骨細胞前體細胞的分化成熟并活化其破骨作用[25]。一項研究顯示，OP小鼠經服ACEI藥物后，可通過調控骨組織局部RANKL、OPG mRNA表達，從而改善骨組織負骨轉換狀態[10]。另一項臨床研究顯示，在骨組織局部部分RAS組分與BMD有一定的相關性，可能通過RANKL/OPG信號傳導通路調節骨代謝[16]，據此，骨組織RAS組分是調控骨代謝的一個重要局部調節系統。本研究還存在一個缺陷，由于樣本量較少，故INFH患者沒有根據其病因區分為酒精性、激素性及特發性INFH進行研究，后期可再此基礎上進一步深入進行研究。

綜上所述，本研究初步探討了RAS雙軸與骨轉換標志物RANKL、OPG及RANKL/OPG在INFH及正常股骨頭局部骨組織中的差異表達，研究顯示，INFH患者骨組織局部RAS雙軸各組分的異常表達，可能影響骨轉換相關調控因子OPG mRNA、RANKL mRNA及RANKL mRNA/OPG mRNA比值，從而影響INFH的病理進展，至于RAS雙軸是否對局部炎癥因子產生影響，是否影響氧化應激反應，是否對局部微循環產生影響等不得而知，此初步結論為后續研究及臨床診治提供基礎及新的思路。

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（收稿日期：2020-03-14）