侯玉麗 付靜軒 王培昌

[摘要] 目的 探討二甲雙胍（Met）通過IGF-1/PI3K/Akt信號通路對細胞衰老的影響。 方法 選取2BS細胞分成四組，即對照（NC）組、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）組、Met組、Met+IGF-1組。加藥處理后進行SA-β-Gal染色檢測細胞衰老水平、CCK8試驗檢測細胞增殖能力、EdU試驗檢測DNA合成能力以及Western blot檢測各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達。 結果 各組SA-β-Gal染色陽性率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。Met+IGF-1組SA-β-Gal染色陽性率低于IGF-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。在相同時間點，Met+IGF-1組OD450值高于IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。EdU染色后在370 nm處的染色結果顯示，各組OD370值比較，差異有統計學意義（P < 0.05）;Met+IGF-1組OD370值高于IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。Met組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量低于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05）。IGF-1組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量高于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05）。Met+IGF-1組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量低于IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 Met可通過抑制IGF-1/PI3K/Akt信號通路來延緩細胞衰老。

[關鍵詞] 二甲雙胍;2BS細胞;胰島素樣生長因子1;PI3K/Akt信號通路;細胞衰老

[中圖分類號] R730? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（b）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the effect of metformin （Met） on cell senescence through IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway. Methods 2BS cells were selected and divided into four groups， namely control （NC） group， insulin-like growth factor-1 （IGF-1） group， Met group， Met+ IGF-1 group. After drug treatment， SA-β-Gal staining was performed to detect cell senescence， CCK8 test was used to detect cell proliferation ability， EdU test was performed to detect DNA synthesis ability， and Western blot? was used to detect the protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， and p-Akt in each group. Results The positive rate of SA-β-Gal staining in each group was compared， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive rate of SA-β-Gal staining in Met+IGF-1 group was lower than that in IGF-1 group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. At the same time point， the OD450 value of the Met+IGF-1 group was higher than that of the IGF-1 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The staining results at 370 nm after EdU staining showed that the OD370 value of each group was compared with statistical significance （P < 0.05）; the OD370 value of the Met+IGF-1 group was higher than that of the IGF-1 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The expressions of p-PI3K and p-Akt protein in Met group were lower than those in other groups， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of p-PI3K and p-Akt protein in IGF-1 group were higher than those in other groups， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expressions of p-PI3K and p-Akt protein in Met+IGF-1 group were lower than those in IGF-1 group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Metformin can delay cell senescence by inhibiting IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway.

[Key words] Metformin; 2BS cells; Insulin-like growth factor 1; PI3K/Akt signaling pathway; Cell senescence

伴隨著人口數量的增長和生活水平的提高，社會正在迅速老齡化，老齡化也是大多數慢性病的主要危險因素[1-3]。二甲雙胍（Metformin，Met）作為治療2型糖尿病的一線用藥，通過增強胰島素敏感性、誘導糖酵解、抑制肝臟糖異生、穩定血糖發揮作用[4]。胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）與受體結合通過 PI3K/Akt信號通路調節細胞過程，包括細胞增殖、代謝、分化、衰老和凋亡等[5-6]。最近研究顯示[7]，Met可以抑制mTOR的激活延緩衰老的進展，但對IGF-1誘導的PI3K/Akt通路的作用機制尚不清楚。因此，本研究通過培養衰老典型細胞2BS，外源性添加Met和IGF-1，檢測2BS細胞衰老指標的變化，探究Met對IGF-1誘導的PI3K/Akt通路的影響，為延緩衰老提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器? CO2培養箱（Thermo Scientific，Forma 371，美國）、多功能酶標分析系統（Tecan Infinite F200，奧地利）和倒置熒光顯微鏡（LeicaCTR4000，德國，Leica）等。

1.1.2 試劑? MEM培養基（11095080，Gibco）;BCA蛋白定量試劑盒（A53226，ThermoFisher）;RIPA（R0010，索萊寶）;β-actin（AF5001）、HRP標記二抗（A0208）、CCK8試劑盒（C0037）、EdU細胞增殖檢測試劑盒（C0088S）、SA-β-Gal染色試劑盒（C0602）購于上海碧云天生物技術有限公司;PI3K（ab32089）、p-PI3K（ab182651）、Akt（ab179463）、p-Akt（ab8805）購于Abcam;Met（HY-B0627，MCE）;IGF-1（8917，CST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養? 2BS細胞購自中國科學院細胞庫，培養條件為MEM培養基加10%FBS和1%青鏈霉素雙抗，于37℃、5%CO2培養。

1.2.2 細胞分組與處理? 傳代細胞隨機分成四組，分別為對照（NC）組、Met組、IGF-1組、Met+IGF-1組。NC組細胞無血清培養24 h后收集蛋白;Met組無血清培養24 h后，加入4 mmol/L Met作用24 h收集蛋白;IGF-1組無血清培養24 h后加入100 ng/mL IGF-1 30 min后收集蛋白;Met+IGF-1組無血清培養24 h后加入4 mmol/L Met作用24 h后加入100 ng/mL IGF-1培養30 min后收集蛋白。

1.2.3 細胞衰老半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色? 吸除細胞培養液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min;吸除固定液，加入1 mL染色工作液，放置于37℃恒溫箱中孵育過夜。鏡下觀察染色，衰老細胞呈深藍色，陰性細胞無著色。各組隨機計數100個細胞中的陽性細胞數，計算陽性細胞率（%），實驗獨立重復3次。

1.2.4 CCK8細胞增殖試驗? 將34代2BS細胞按每孔10 μL 2000個細胞傳代至96孔板中，貼壁后加入不同藥物處理，每孔加入100 μL培養基和10 μL CCK-8溶液，孵育1.5 h，連續監測5 d，實驗獨立重復3次。

1.2.5 EdU細胞增殖試驗? 在細胞培養液中加入EdU工作液孵育2 h。去除工作液，加入1 mL固定液，室溫15 min后洗滌。加入1 mL通透液，室溫15 min后洗滌。再用內源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20 min，隨后洗滌，加入EdU顯色液進行檢測，實驗獨立重復3次。

1.2.6 Western blot? 用100 μL RIPA裂解細胞，冰上靜置30 min，離心半徑10 cm，12 000 r/min離心10 min，吸取上清。蛋白電泳條帶轉移至PVDF膜后以1∶1000稀釋的一抗在4℃條件下震蕩孵育過夜。以1∶5000稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，ECL顯色，結果用凝膠成像系統照相保存。β-actin作為內參，實驗獨立重復3次。

1.3 統計學方法

用Graph Pad Prism 5軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，三組及以上比較采用方差分析或重復方差分析。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SA-β-Gal染色陽性率比較

NC組SA-β-Gal染色陽性率為（69.33±2.40）%，Met組為（34.67±4.37）%，IGF-1組為（86.00±3.46）%，Met+IGF-1組（53.33±3.53）%。各組SA-β-Gal染色陽性率比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。Met+IGF-1組SA-β-Gal染色陽性率低于IGF-1組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。各組細胞的SA-β-Gal染色和陽性率結果見圖1。

2.2 CCK8細胞增殖能力比較

在相同時間點，Met組OD450值最高，IGF-1組OD450值最低，Met+IGF-1組OD450值高于IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。各組細胞連續5 d增殖曲線見圖2。

2.3 EdU細胞DNA合成能力比較

EdU染色后在370 nm處的染色結果顯示，Met組OD370值最高，IGF-1組OD370值最低，差異有統計學意義（P < 0.05）;Met+IGF-1組OD370值高于IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。各組細胞EdU染色結果見圖3。

2.4 Western blot檢測各組細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的蛋白水平

四組PI3K、Akt蛋白表達比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。Met組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量低于NC組、IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。IGF-1組p-PI3K、p-Akt蛋白表達量高于NC組及Met+IGF-1組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

衰老的特點是細胞形態和衰老相關基因的一系列特殊變化[8]。衰老時相關基因及通路發生改變導致衰老表型的出現[9]。研究提示高血糖和高胰島素血癥是衰老的重要因素[10]，高糖狀態通過抑制細胞增殖、細胞存活能力而促進細胞衰老[11]。高糖狀態下IGF-1因子分泌增多，通過PI3K/Akt/mTOR信號通路進行細胞功能的調控[12]。在蠕蟲、昆蟲和哺乳動物的研究顯示[13-14]，IGF-1/PI3K/Akt信號通路參與細胞衰老的調控。在小鼠中，將IGF-1受體突變后，小鼠壽命延長。在肥胖癥患者和轉基因小鼠中，IGF-1高表達的同時老齡病的發病率升高，壽命縮短[15]。降糖藥Met可以降低血糖、提高葡萄糖利用率，同時還可以通過抑制IGF-1信號通路來對糖尿病患者進行治療[16-17]。在果蠅中，高濃度Met喂養可以延長果蠅壽命，同樣的結果在蠕蟲、大鼠和兔子中被發現[18]。本實驗從細胞水平和信號傳導水平研究Met在衰老中的作用機制。

本研究顯示，2BS細胞經Met刺激后，SA-β-Gal染色水平顯著降低，細胞增殖能力升高、DNA合成能力增強，提示Met可以延緩細胞衰老。除此之外，Met還可以使p-PI3K、p-Akt表達降低，抑制PI3K/Akt信號通路的活化。2BS細胞加入IGF-1刺激后，SA-β-gal染色陽性率顯著升高，細胞增殖能力和DNA合成能力減弱。Western blot結果顯示，IGF-1刺激后PI3K和Akt水平不變，p-PI3K和p-Akt水平升高，提示IGF-1可以刺激下游的PI3K/Akt信號通路，使PI3K磷酸化為p-PI3K，Akt活化為p-Akt而發揮作用。提示IGF-1可以通過激活PI3K/Akt信號通路來促進細胞衰老，這與其他研究結果相一致[19-20]。進一步研究發現，Met+IGF-1組SA-β-gal染色水平低于IGF-1組，細胞增殖能力和DNA合成水平高于IGF-1組，并且p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平也低于IGF-1組，提示Met可以從一定程度上抑制IGF-1介導的PI3K/Akt信號通路，從而延緩衰老。

本實驗顯示，Met可以通過抑制IGF-1介導的PI3K/Akt信號通路來延緩衰老，這為延緩衰老提供了新的實驗思路。然而，影響衰老的因子以及通路眾多，本實驗未研究Met對衰老影響涉及的所有通路，因此，需要進一步研究來完善Met對衰老影響的其他可能機制。

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（收稿日期：2020-02-20）