在4 ℃降溫平衡過程中0.2g/L咖啡因與精子共孵育時間對豬顆粒凍精質量的影響

郭雅欣 ，張學煒 ，鄭 梓 ，李 寧 ，陳 亮 ，穆淑琴 ，李千軍 ，崔茂盛 *

（1.天津農學院，天津 300380；2.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300384；3. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100094）

1 引言

隨著豬場集約化、規模化發展，豬冷凍精液在長期保存、長途運輸和跨區域品種改良以及區域或全國范圍內種豬聯合育種等方面具有獨特的技術優勢和重要的現實意義。尤其在目前非洲豬瘟防控壓力下，通過豬精液質量監控和冷凍精液無菌化操作，利用凍精輸精可大大降低由于種公豬引進而帶來的疾病傳播風險，有力促進種豬種質資源的交流[1]。

目前豬精液冷凍形式主要有顆粒法和細管法兩種，這兩種方法各有優勢。細管法冷凍效果較好，在保存和運輸中可有效避免凍精之間的交叉感染，且已在國內外部分種豬場開展生產應用，取得了較好的應用效果[2]，但細管法需要昂貴的儀器設備和專業的人才培訓，限制了豬場內凍精生產和應用。顆粒法制作凍精不需要高昂的設備與系統的人員培訓，相對來說更易應用推廣，但顆粒凍精的質量相對較低[3]。為提高豬精子冷凍效果，前人已在優化豬精子冷凍液成分，如酸堿緩沖體系、能量物質、保護劑等方面做了大量研究與探討。在稀釋液中添加紅景天和糖褐藻膠等物質，可提升精子活率、線粒體完整率和頂體完整率[4]，在精液冷凍保存中加入丹參酮IIA、靈芝多糖、蘆丁[5]、褪黑素[6]、L-半胱氨酸[7]等物質可減少精子氧化損傷，提升凍精質量等。咖啡因是從可可樹、茶葉、咖啡豆等植物中提煉出來的一種生物堿，具有刺激精子活動、提高精子活力和解凍后頂體完整率等作用[8]。前人雖然在豬精液細管冷凍過程中添加不同濃度咖啡因[9]，以及顆粒凍精解凍液中添加咖啡因[10]等試驗進行了多方面研究，探討了咖啡因對冷凍精子質量的影響。谷合勇等人研究指出冷凍液中0.2 mg/mL的咖啡因添加量，可顯著提高豬細管凍精解凍后精子活力、質膜完整率與頂體完整率等[11]。但在豬顆粒凍精制作過程中，咖啡因與精液共孵育時間長短對凍精質量有何影響，尚未見相關報道。在團隊前期工作基礎上，探討0.2 g/L咖啡因與精液共孵育2 h、1 h和0.5 h對豬顆粒凍精質量的影響，以期進一步提高豬精液顆粒冷凍效果。

2 材料與方法

2.1 豬精液采集

使用手握法采集某豬場大白公豬精液，收集中段精子密度較高的部分。選擇顏色乳白、無惡臭、密度在1.5億個/mL以上、精子活率在85%以上、精子畸形率低于5%的原精，用等溫BTS液按1∶1對原精稀釋后，置于37 ℃保溫瓶中0.5 h內帶回到實驗室。

2.2 主要試劑設備

主要試劑：半胱氨酸、葡萄糖、青霉素、鏈霉素、碳酸氫鈉、EDTA等；主要儀器設備：17 ℃恒溫箱、4 ℃冰箱、離心機、電熱恒溫水槽、電子天平等。

2.2.1 冷凍稀釋液配制

冷凍Ⅰ液配制：檸檬酸1.25 g，葡萄糖1.18 g，Tris 2.428 g，乳糖20 g，半胱氨酸0.02 g，加蒸餾水至100 mL，調pH至6.21。加入體積百分比為20%的新鮮雞蛋卵黃，最后加入青霉素0.6 g/L和鏈霉素1 g/L經磁力攪拌器充分攪拌均勻；冷凍Ⅱ液配制：在I液基礎上加入體積百分比為9%的甘油。

2.2.2 精液的稀釋與平衡

將帶回的精液在室溫下靜置0.5 h，平均分裝于50 mL 康寧（Corning）離心管中，以2 000 r/min離心6 min，棄上清液后按1∶1等溫緩慢加入冷凍稀釋Ⅰ液并輕輕搖勻，然后在17 ℃恒溫箱中平衡1 h，轉入4 ℃冰箱中繼續平衡2 h。分別在4 ℃平衡的0、1和1.5 h組離心管內添加0.2 g/L的咖啡因。4 ℃平衡結束后在等溫條件下按2∶1體積比與冷凍Ⅱ液混合均勻，再平衡15 min開始滴凍。

2.2.3 豬精液顆粒凍精制作

實驗利用長和寬稍大于氟板、深度約7 cm的泡沫箱作為冷凍槽。實驗前在泡沫箱內倒入1/3體積的液氮，將氟板沉入液氮內充分浸泡后放在特制的冷凍架上，并調整冷凍架與液氮面的距離，使氟板溫度在- 120～- 110 ℃之間，蓋上泡沫盒蓋平衡2 min后開始滴凍。滴凍時用預冷的根據氟板量身定制的多重排槍（已授權實用新型專利，2013年），可一次性完成30粒滴凍，每批滴凍顆粒90粒，總滴凍時間控制在30 s以內。滴凍后迅速蓋上槽蓋平衡6 min，然后將氟板快速沉入冷凍槽內的液氮中，再蓋上蓋子平衡5 min以上，隨機取出3粒凍精進行解凍、質量檢查。

2.2.4 顆粒凍精解凍

實驗采用濕解法，解凍液為含有0.1%半胱氨酸和0.05%肌醇的BTS液，解凍溫度為45 ℃。解凍時隨機取出1粒凍精在空中晃動3～5 s，然后快速放入含有0.5 mL的已充分預熱的解凍液的圓底玻璃試管中，在45 ℃水浴鍋內快速搖動試管，待凍精顆粒溶解致2/3時迅速將試管離開水浴鍋，借助余熱使凍精顆粒完全融化。解凍結束后在室溫下平衡5 min，開始凍精質量檢測檢。檢測指標為精子活率、活力、質膜完整性和頂體完整性及室溫下精子存活時間等指標。

2.2.5 凍精質量評價方法

1）精子活率

伊紅-苯胺黑聯合染色法判斷精子活性，死精子質膜通透性增大，染料進入膜內染色，呈紅色；而該染料透不過活精子膜，因此活精子不著色。實驗中，在體式顯微鏡100倍視野下計數200個精子，計算未著色（活精子）占200個精子的百分率，即為活率。

2）精子活力

在體式顯微鏡100倍視野下計數精液中直線前進運動精子數占總精子數的百分比，即為活力。

3）質膜完整性

采用低滲腫脹實驗（HOST）法進行精子質膜完整性的檢測。質膜完整的精子尾巴因為低滲腫脹而呈現出較大彎曲，而質膜破裂的精子，不會出現低滲腫脹現象，其尾巴不彎曲或稍微彎曲。

4）頂體完整性

對精子頂體完整性采用金霉素（CTC）熒光染色法進行檢測。在實驗中，精子經過CTC熒光染色后精子整個頭部呈現均一熒光，為頂體完整的精子；整個精子頭部無熒光或非常弱的熒光，為頂體不完整的精子。

2.3 實驗設計

精液在4 ℃冰箱中平衡2 h的過程中，分別設計在開始平衡的0 h、1 h和1.5 h三個時間點向冷凍稀釋液中添加0.2 g/L咖啡因，則咖啡因與精液共孵育時間分別為2 h、1 h和0.5 h，實驗中設定無咖啡因添加組為對照組。通過檢測冷凍前后精子活率、活力、質膜完整性和頂體完整性以及解凍后精子體外存活時間等指標。探討在4 ℃平衡過程中咖啡因與精液不同共孵育時間對冷凍前后精子質量的影響。

2.4 數據處理

實驗數據使用Microsoft Excel進行初步整理，再利用SPSS 20.0對試驗數據進行差異顯著性統計分析。采用單因素方差分析、利用LSD法進行多重比較。數據均使用“平均值±標準誤(Mean±SE)”的形式進行表示。P＜0.05表示差異顯著，反之則表示差異不顯著。

3 結果與分析

3.1 咖啡因不同平衡時間對冷凍前精子質量的影響

由表1可知，咖啡因與精液不同共孵育時間組活率和活力都呈現出升高趨勢，但相較對照組差異不顯著；但在頂體完整率和質膜完整率上，對照組分別為 (83.03 ±0.20與 84.32 ±0.21)，顯著高于共孵育2 h、1 h和0.5 h組，后3組之間差異均不顯著。精子質膜完整性、頂體完整性和活率等染色圖片分別如圖1、圖2和圖3所示。

3.2 咖啡因不同平衡時間對冷凍解凍后精子質量的影響

由表2可看出，精液和咖啡因共孵育組顆粒凍精，解凍后精子活率和活力均顯著高于對照組，其中共孵育1 h組顯著高于其他3組（P＜0.05），共孵育2 h組和0.5 h組間差異不顯著（P＞0.05）；在頂體完整率和質膜完整率上，共孵育2 h組顯著低于對照組和共孵育0.5 h、1 h組（P＜ 0.05），但后 3組精子頂體完整率和質膜完整率差異均不顯著；對解凍后精子體外存活時間而言，咖啡因與精子共孵育2 h組精子存活時間顯著低于對照組、共孵育1 h和0.5 h組（P＜0.05），雖然共孵育1 h組精子存活時間最長，但相對于共孵育0.5 h組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。

4 討論

在精液冷凍前，0.2 g/L的咖啡因與精液共孵育并沒有顯著提高精子的活率和活力。這可能與原精質量本身較好相關，在實驗中，原精活率和活力檢測結果分別在0.85和0.9以上。實際上，研究結果顯示0.2 g/L咖啡因不同共孵育時間，均有提高精子活率和活力的趨勢，但沒有統計學上的差異。在檢測精子質膜完整性和頂體完整性時發現，對照組的質膜完整率和頂體完整率，顯著高于平衡2 h、1 h和0.5 h組，后3組之間差異均不顯著。研究推測，這可能和咖啡因添加組精子活率和活力升高有關。據研究表明，咖啡因具有刺激精子神經中樞的作用，在增加精子的運動劇烈程度的同時[12]，精子內線粒體活性也進一步活化，產生更多的ATP給精子提供能量[13]，而較強且持續的能量代謝導致精子產生過量的活性氧[14]，對精子細胞器和質膜造成傷害，另外較高咖啡因物質的攝入，還會增加精子膜的通透性，從而在提高質膜內外物質交換的同時，可能會降低質膜的完整率和頂體完整性。然而此次研究結果又表明，平衡2 h、1 h和0.5 h組精子質膜完整性和頂體完整性之間差異并不顯著，此研究結果與2 h、1 h和0.5 h 這3組之間精子活率和活力差異不顯著的結果一致。

表1 咖啡因不同平衡時間對冷凍前豬精子質量的影響 %

表2 顆粒凍精解凍后精子質量檢測 %

豬顆粒凍精解凍后的精子質量檢測結果表明，0.2 mg/mL咖啡因共孵育的3組中精子活率和活力均顯著高于對照組，該結果與金穗華[15]、黃全成[16]、Pariz[13]等人的研究結果一致；同時此次實驗進一步表明，在4 ℃條件下0.2 mg/mL咖啡因與精液共孵育1 h組精子活率和活力顯著高于共孵育2 h和0.5 h組（P＜0.05）。有研究表明，雖然咖啡因能夠提高冷凍后精子活率和質膜完整性[17]，但長時間的咖啡因刺激，不僅會導致解凍后精子活率、活力的降低，而且還會因活性氧的產生對精子質膜造成傷害[14]。從此次實驗結果可知，在實驗條件下0.2 mg/mL咖啡因與精液共孵育時間為1 h，對凍后精子活率和活力最有利。在精子質膜完整率和頂體完整率方面，咖啡因平衡2 h組均顯著低于對照組和平衡1 h、0.5 h組（P＜0.05），而后3組之間精子質膜完整率和頂體完整率差異均不顯著。該結果進一步表明，較長時間的咖啡因與精液共孵育，會對解凍后精子質量產生不利影響。同時，實驗中咖啡因與精液共孵育1 h和0.5 h兩組中的精子質膜完整率和頂體完整率均與對照組之間差異不顯著。此結果說明，0.2 mg/mL咖啡因與精液0.5 h～1 h的共孵育，不會對解凍后精子質膜完整性和頂體完整性造成不利影響。解凍后精子體外存活時間也顯示，咖啡因平衡2 h組凍后精子存活時間僅有3 d，其顯著低于對照組、平衡1 h和平衡0.5 h組（P＜0.05），后3組凍后精子存活時間都在6 d以上，其中平衡1 h組凍后精子存活時間達到7 d以上。此結果與咖啡因平衡2 h組中精子在冷凍之前超活化時間長[18]、消耗能量多[12]以及精子中產生的活性氧多[14]等，都有緊密聯系。

5 結論

豬精子在4 ℃平衡過程中，相對于咖啡因與精液共孵育2 h和0.5 h而言，共孵育時間為1 h對解凍后精子質量最有利，該組中解凍后精子活率和活力顯著高于對照組和平衡2 h和0.5 h組，而且該組中凍后精子體外存活時間長達7 d以上。