豬冷凍精液在我國的應用現狀和存在的問題

潘紅梅 ，彭 剛 ，吳 玲 ，肖杰秋 ，徐 榮

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460;2.重慶市武隆區畜牧發展中心，重慶 408500;3.云南省綏江縣動物衛生監督所，云南 綏江 657700)

2009 年起，國家對購買良種豬精液給予補貼，在全國范圍內推廣豬人工授精技術，種豬常溫精液人工授精在我國全面普及。具有一定規模和較強經濟實力的社會化公豬站在全國各地建立起來，逐漸形成一個完備的全國種豬常溫精液供精網絡體系，積極推動了全國豬遺傳改良計劃的全面實施。各大種豬場間通過優質種公豬精液的交流來建立和增強場間遺傳聯系和跨群聯系。但種豬常溫精液保存時間短，保存條件和運輸要求高等特點限制了其在遠距離交流中的作用，而豬冷凍精液則能有效克服這些限制。冷凍精液能最大限度地存留頂級公豬的遺傳材料，為檢測人員提供足夠的時間檢測精液中可能攜帶的各種病原，有效地提高了精液交流中的生物安全保障。還可以在完成供精種公豬的后裔測定后，再確定是否擴大該公豬精液的配種母豬數，以獲得更大的遺傳進展。

但豬精子對“冷休克”敏感，使得冷凍和解凍過程中的所有的操作環節都會對精子造成損傷，很難保證精子解凍后質量的穩定性，以致豬冷凍精液在商業化的道路上進展緩慢。

1 豬冷凍精液的發展概述

豬的精液冷凍保存研究始于20 世紀50年代，1966年King等[1]將制作牛冷凍精液的成功方法用來冷凍豬的精液，精子解凍后活力為20%～50%，但解凍精子在37 ℃下存活不到5 h。同時，King將冷凍精液對19頭經產母豬和5頭初產母豬進行輸配，全部返情。直至1970年，Polge 等[2]才通過手術法將豬的冷凍精液直接注入輸卵管，首次獲得冷凍精液配種生產的仔豬。1年后，Crabo and Einarrsson（1971），Graham（1971）及 Pursel and Johnson（1971） 分別報道通過豬子宮頸人工授精的方法，給母豬輸配冷凍精液可令母豬受精[3]。從此，各國科研人員在豬精液冷凍技術及相關領域展開全面研究。

全世界研究者們將各自在豬精液的冷凍保存機理、方法、技術關鍵環節、冷凍保護劑等方面的研究進展在豬精液冷凍保存國際會議（International Conference on Boar Semen Preservation）上進行交流，至2019年，該國際會議已經召開了 9 次，每一次會議的召開，都積極地推動了豬精液冷凍保存技術的發展。

2 我國早期的豬精液冷凍技術研究回顧

我國對豬精液冷凍技術的研究起步較晚，但發展迅速，成績顯著。從1973年開始在廣東、廣西等省、區相繼開始進行公豬精液冷凍實驗。1975年5月12日，廣西畜牧所成功獲得我國首例凍精配種生產的仔豬，窩產13頭，全部成活[4]。截至1976年底廣西、廣東、陜西等多地已對4 000多頭次母豬進行凍精輸配，情期受胎率一般在30%～40 %，個別單位達到70 %[5]。1977年成立全國豬精液冷凍技術研究協作組，對冷凍精液的制作、稀釋液篩選、凍精解凍程序、凍精質量評價及凍精配種等問題開展研究。據不完全統計，1975-1983年全國各地對21 859頭母豬進行凍精輸配，平均情期受胎率為56.25%，窩產仔平均為8.18頭[6]，其中，杭州市農業科學研究院的凍精受胎率高達82.38%，配種產仔率高達72.95%[7]。

據張繼慈的翻譯文章中報道[8]，日本6年（1982-1987年）來共使用顆粒凍精輸配母豬4 008頭，受胎率平均為39.6%，到1987年受胎率平均為49.4%，共產仔1 437窩，平均窩產仔數為8.0頭。許懷讓的翻譯文章中提到[9]，在理想的實驗室或實驗農場條件下，凍精配種的產仔率可達60 %。在良好環境下，平均產仔率為55%，在典型商業性豬場中產仔率可能低于50 %，而用鮮精（或稀釋鮮精）進行人工授精，可獲得80%的產仔率。由此可見，我國在豬精液冷凍保存研究的早期，受胎率遠遠超過日本，在一定程度上與歐美相似，甚至略高于歐美。

我國早期豬精液冷凍技術研究的主要特點是以領導、工人、技術人員相結合，大搞群眾運動。當時我國物質資源相當匱乏，不但缺少完成實驗研究所需的必要儀器設備，連凍精配種所需的母豬都是極稀少的。在如此艱苦的條件下，能結集全國各地如此多的力量，在短期內完成如此大規模的凍精輸配實驗，取得舉世矚目的成績，與政府的支持和相關單位的積極參與和全力投入是分不開的。

3 我國豬精液冷凍技術研究與應用現狀

由圖1可知，我國在20世紀90年代，對豬精液冷凍保存的研究有一段相對停滯期，這段時間，僅有少數幾個研究者在持續開展豬冷凍精液的研究。從2003年以后才重新掀起豬冷凍精液的研究熱，至2010年，相關的中文文章發表達到一個高潮，一年內發表文章超過30篇。筆者分析有以下原因：

隨著改革開放在我國深入展開，在市場經濟指導下的養豬行業發生了天翻地覆的變化。母豬的快繁高產技術成為繁殖學科在養豬上的重點攻關技術。快繁高產技術體系中的重要成員種豬常溫精液的人工授精技術迎來發展的春天。國家實施生豬良種補貼政策，直接補貼種豬常溫精液，全面推進我國種豬常溫精液人工授精技術的普及，人工授精技術水平全面提高。

然而，隨著全國豬聯合育種工作的開展，常溫精液的局限性也顯露出來。如場間精液交流的生物安全性、遠程精液運輸的時效性、頂級種公豬遺傳物質的最大限度的利用、地方豬遺傳資源的靜態保存、夏季常溫精液質量差等一系列常溫精液不能解決的問題再次呈現在從業者面前。從而，大家再次將目光轉移至種豬精液冷凍上來。

當我們都在關注種豬常溫精液的人工授精技術時，歐美國家并未停止冷凍精液的研究。他們研究了用塑料細管作為冷凍精液的載體，同時開發了程序化冷凍設備及相應的計算機輔助精液質量檢測系統。借助先進的精液冷凍設備，美國和加拿大向世界各國出售其優質種豬冷凍精液。至此，我國開始從國外引進生產冷凍精液的設備、技術及種豬冷凍精液，開啟了邊研究邊引進的豬冷凍精液發展進程。隨著冷凍精液專用設備的研發和配套的豬人工授精技術的進步，豬精液冷凍研究與應用在我國發展迅速。近年來，國內百鈞達、北京田園奧瑞等公司相繼研發了豬精液冷凍保存技術，自主開發冷凍保護劑和精液冷凍設備，并在全國范圍內開始豬冷凍精液的商業化生產、銷售[10]。廣東溫氏、上海祥欣等國內知名育種企業已相繼建立豬冷凍精液商業化生產平臺，能為國內外客戶提供優質遺傳資源，并為客戶提供配套的人工授精技術指導。表1中列出近20年我國部分豬場種豬冷凍精液應用情況。

表1 近20年我國部分豬場種豬冷凍精液應用情況表

由表1可知，近20年來，我國豬冷凍精液技術發展迅速，進展喜人。尤其是商業化的應用開發團隊百均達、田園奧瑞的掘起，加速種豬冷凍精液的質量提升，不論在配種受胎率還是窩產活仔數上都相比早期的顆粒凍精時代有了質的飛躍。同時，對比國產豬凍精和國外引進豬凍精的配種產仔成績不難發現，國產凍精配種的的受胎率、配種分娩率及窩產活仔數均已遠超國外引進凍精。尤其是海南羅牛山的凍精，竟達到100%的配種分娩率，而重慶農投2016年從英國引進的凍精配種分娩率僅達11.11%，且窩產活仔數只有4頭。筆者所在的團隊也對百均達的凍精和加拿大的凍精配種結果作了比較，配種結果表明，百均達凍精配種分娩率為57.81%，窩產活仔數8.3頭；加拿大引進凍精配種分娩率40.54%，窩產活仔數8.53頭（數據未發表），國產凍精配種成績優于加拿大引進凍精。

4 存在的問題

盡管目前我國豬冷凍精液質量已提高到世界先進水平，商業化應用逐漸擴大，但豬冷凍精液要完全實現商業化應用仍有很長的路要走。

4.1 豬精液冷凍損傷的機理研究不足，無法從根本上解決豬精子耐凍性差的問題

精子的冷凍損傷包括物理損傷、化學損傷和自身氧化損傷3類，這些損傷貫穿整個冷凍-解凍過程。目前，在冷凍程序上，通過程序降溫儀可有效控制降溫速度和解凍速度，在一定程度上可有效降低物理冰晶對精子的損傷；而冷凍保護劑的不斷改進，冷凍過程中的精子受到的化學性損傷也在逐漸改善。但是，在冷凍降溫過程中，精子細胞內會產生大量活性氧（ROS），過量的ROS在細胞內堆積，引發精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發生過氧化反應，產生大量脂類過氧化物，導致精子質膜破損，DNA鏈斷裂，核染色質損傷，精子呼吸被抑制，蛋白質氧化損傷等[22]。由于豬精子膜上的不飽和脂類含量較其他物種高，更容易發生氧化反應，導致豬精子冷凍質量低下，因此氧化性損傷對豬精液冷凍影響更大。

近年來，蛋白組學研究已發展成生命科學領域的新技術，蛋白表達的檢測、蛋白間相互作用的檢測等技術被廣泛應用。將蛋白組學的研究方法用于精子損傷機理，尤其是冷凍過程中大分子蛋白質損傷的研究，有望進一步揭示精子冷凍損傷的機理及提高精子的冷凍保存效率，加速推動豬精液冷凍保存技術進展。

4.2 豬精子對溫度的變化敏感，溫控設備價格昂貴

豬精液冷凍工藝流程中基本上有 11 個技術環節涉及到溫度條件：原精液活力檢測→原精液稀釋、自然降至室溫→轉入恒溫箱（17 ℃）中恒溫保存→17℃ 環境條件離心→棄上清液、等溫添加無甘油稀釋液→置低溫柜（3～5 ℃）降溫、平衡→平衡溫度下添加含甘油稀釋液→平衡溫度下封裝細管精液→置入冷凍程序儀器進行精液冷凍→細管凍精分裝保存→細管凍精解凍→解凍后精子活率質量檢測分析。在這個工藝流程中涉及的溫控設備有空調、顯微鏡恒溫臺、17℃恒溫箱、溫控離心機、4℃低溫操作柜、程序冷凍儀、細管分裝儀、恒溫水浴鍋等。配齊一套完整的設備，需要配備專門的實驗室，且設備采購費用高昂，一般養豬企業難以實現。少數企業或單位具備冷凍精液的制作條件，也限制了豬冷凍精液在實際生產中的推廣應用。

4.3 適合制作冷凍精液公豬的篩選

徐章龍[7]在1980年對23頭公豬精液耐凍性測試中，發現豬只個體間精液耐凍性差異很大，不同個體的凍精受胎率也有差異。他認為有必要測試公豬原精液的各項指標和耐凍性，而且解凍后的活力并不表示受胎率，要想提高豬冷凍精液的質量和受胎率，需要對供精公豬精子的耐凍性和受胎率進行檢測。但時至今日，40年時間過去，關于供精公豬精子耐凍性檢測和精子受胎能力檢測的問題依然沒有解決。目前仍采用大量的冷凍實驗來篩選耐凍精子的供應體，而凍精受胎能力則需要對其多次配種結果分析才能獲得。這些方法工作量大，耗時長，不適應商業化生產要求。希望在以后的研究中能找到相關的差異基因，研制出有效檢測試劑盒，以提高凍精公豬的選擇能力，擴大冷凍精液的生產量。

4.4 不同飼養管理條件的豬場配種產仔成績差異顯著

據陳獻欣[17]報道，廣西農墾永新畜牧集團有限公司于2016年分別在傳統飼養方式和全程空氣過濾模式的兩種豬場，開展冷凍精液配種試驗，將加拿大引進的精液在傳統場輸配母豬51頭，配種產仔率49.02%，窩產活仔數7.48頭；在全程空氣過濾場輸配母豬99頭，配種產仔率69.70%，窩產活仔數7.81頭。上海祥欣[18]采用百均達的凍精在國家生豬核心育種場配種，配種分娩率高過80.87%，窩產活仔數高達9.75頭；而筆者采用百均達凍精在小規模商品豬養殖場配種，配種分娩率為57.81%，窩產活仔數8.3頭（數據未發表）。由此可見，冷凍精液配種產仔成績與豬場的飼養管理條件密切相關。對大多數硬件條件不過硬，飼養管理水平不夠高的豬場，冷凍精液要達到普通常溫精液的生產成績，還有很長的路要走。

4.5 對母豬的胎次和健康狀況要求高，不被普通豬場接受

從幾十年凍精配種經驗得知，采用冷凍精液配種對母豬的胎次和健康狀況要求都很高。一般要選擇3～5胎的經產母豬，且要求這些母豬在斷奶后4～6 d能正常發情。這樣的母豬凍配后才能獲得較高的受胎率和窩產仔數。但在實際生產中，這類母豬在普通條件的豬場是提高生產成績的中堅力量，通常采用常溫精液配種，它們的受胎率能達到90%以上，窩產活仔數超過12頭。如此大的差距，是普通生產場所不能接受的。因此，冷凍精液在全國范圍內大面積推廣，還很困難。

4.6 配種時間的掌握要求精準，對配種員技術水平要求高

雖然商業售賣的豬冷凍精液解凍和稀釋后仍具有較高的活力，但精子在冷凍-解凍過程中均遭受到不同程度的損傷，導致它在母豬生殖道的獲能存活時間大大縮短，致使受胎率、配種產仔率及產活仔數等繁殖指標明顯低于液態保存精液。

做好母豬的發情鑒定，準確判斷母豬的排卵時間，把握好準確的輸精時間至關重要。對配種員的發情鑒定技術和深部輸精技術要求更高。有專家提出冷凍精液的理想受精時間往往在母豬排卵前的4～6 h范圍內，使用凍精配種的豬場應把母豬的發情鑒定次數由原來的2次/d增加到 3次/d(即早上5:00，中午13:00，晚上21:00)，以提高凍配母豬的受胎率和窩產仔數。

4.7 冷凍精液質量穩定性差，每次輸配總精子數不好把握

豬冷凍精液作為一種特殊的生物產品，其質量影響因素諸多，質量極易出現波動，精液冷凍過程中任何一個關鍵技術環節上的失誤可導致全過程的失敗。即使來自同一頭供體公豬的精液由同一個人凍存，不同采精批次，不同的人解凍操作，都會出現差異性的結果。面對這種情況，在精液解凍后，輸配前質量評定及輸配精液數量的把握至關重要。前人的研究結果表明，凍精輸精時，有效精子數量越多，配種產仔率和受胎率越高。

4.8 缺少相關的技術標準，很難對凍精質量進行標準化評價

2017年河北省頒發《豬冷凍精液》（DB13/T 2633-2017）的地方標準，這是我國第1個關于豬冷凍精液產品要求的標準。目前，全國多個地區或單位均在開展豬冷凍精液標準的起草和研究。但與精子運動能力和受精能力密切相關的質膜、頂體、線粒體膜等直接關系精子受精能力的質量指標至今沒有好的檢測方法。我們還需要繼續加強對冷凍精子質量評價方法的研究，并在相關檢測單位和檢測人員中進行試用和調研。制訂出操作簡便，重復性好的評價方法，能客觀評定凍精質量的標準，是我們在實際生產中推廣凍精，有效監督的前提。

5 結論

隨著豬人工授精技術的發展，公母豬配種比例從1∶20的本交，發展到1∶200或1∶300的普通常溫精液輸精，再到1∶400的低劑量輸精技術，在減少種公豬飼養數量的同時，更大程度地發揮優質公豬的遺傳潛力。而冷凍精液配合深部輸精技術可以將優質公豬的配種比例增加到1∶1 000，可以實現優良基因的最大化利用。未來我國生豬改良計劃的實現，需要優質種公豬的冷凍精液參與，而優質冷凍精液的應用和推廣需要全國上下同心，共同努力才能實現。

在政府層面上，我們需要政府的資金和政策的支持。我國在20世紀70年代啟動的豬冷凍精液研究在各級政府的大力支持下，全國幾十個科研院所聯合攻關，在短短十多年的時間里，取得舉世矚目的重大成績。但自此以后，豬的冷凍精液研究進展總是斷斷續續，上到國家、下到基層科研院所，極少有相關的項目支持，基本都是感興趣的學者和企業在小范圍內獨自研究。如果國家能給予持續的政策和經費的支持，豬的精液冷凍保存技術應該會有一個新的提升。

科研院所方面，需要加大人力投入，從冷凍機理、冷凍保護劑的開發、冷凍技術、程序設計等方面對現有技術進行系統梳理，提出其中的難點、可攻克點，有針對性地逐項研究攻關，形成應用于生產的技術規范，努力提高豬冷凍精液冷凍-解凍后的配種成績。

養豬企業方面，配合科研院所的新技術應用研究與推廣，提供種公豬精液材料和種豬選育資料，力爭將遺傳性能測定后的優秀公豬精液用于制作凍精，最大限度發揮優質公豬的遺傳潛力。同時，借助國家生豬交易平臺，將冷凍精液的可溯源產品信息發布出來，在平臺上公開。

總之，我們目前在豬冷凍精液方面的產學研幾條線各自為政，相互間的關聯嚴重脫節。希望政府能給予支持，倡導相關行業聯動起來，共同促進種豬冷凍精液的質量提升和標準化、商業化應用。