豬精液冷凍關鍵技術的研究與應用探析

王懷禹

（南充職業技術學院，四川 南充 637131）

人們受牛精液冷凍技術的啟發，從20世紀60年代開始了豬精液冷凍的制作研究，近年來，其受到全球養豬業的高度重視和廣泛關注，世界范圍的研究者為其開展了大量的工作，取得了一定的成效。我國從20世紀50年代初期就開始了對豬精液冷凍技術的探究，但由于缺乏持續性，研究進展不大，但近幾年，像溫氏集團、百鈞達科技發展（北京）有限公司及中國農業大學等單位都在積極進行豬冷凍精液的研究，取得了不錯的效果。總體來看，豬精液冷凍技術的研究雖然走過了近70年的探索歷程，對其工藝流程也進行了不斷優化，鑒于豬精子有區別于牛羊精子的生理特性，精子在冷凍和解凍過程中更易受到損傷，致使母豬繁殖成績不理想，導致目前凍精的使用仍沒有得到大范圍推廣。但這并不妨礙人們探索豬精液冷凍技術的步伐，豬精液冷凍所帶來的諸多益處及廣闊的應用和發展前景也非常值得研究者繼續為之做出努力，豬精液冷凍工藝流程中任何一個環節所能取得的進展，都可為今后豬冷凍精液標準化、規模化生產提供依據。

1 豬精液冷凍技術操作流程

豬精液冷凍制作的劑型主要有顆粒凍精、0.25/0.5/5 mL規格細管凍精以及5 mL扁平塑料袋凍精幾種。目前，國內豬精液冷凍工藝流程基本相同（如圖1）。

2 豬精液冷凍關鍵技術環節研究及應用

2.1 精液采集與品質鑒定

優質的精液是制作冷凍精液的基礎和前提，因此，除需要保證公豬良好的飼養管理條件外，對公豬精液的采集是尤為重要的。個別規模化豬場采用了自動采精系統，但仍有相當部分豬場采用的是傳統的手握法采精，這就要求工作人員必須按照規范的程序實施采精。主要注意不要污染精液，精液中的膠狀物質要棄去，只收集豬射精中間部分的精液。精液品質鑒定遵循先外觀后微觀的操作步驟，即先觀察精液的顏色、氣味、采精量幾個方面是否正常，然后再在顯微鏡下觀察精子的活率、密度、畸形率及頂體異常率是否在正常范圍內（如表1）。

2.2 稀釋液成分的優化

精液稀釋液既可以擴大精液的容量，又可以保護稀釋后的精子，因此，優質的精液稀釋液是提高凍精質量的重要一環。豬精液凍精稀釋液的主要成分見表2。豬冷凍精液稀釋液成分的優化一直是精液冷凍研究的熱點，主要集中在營養劑、抗凍劑和抗氧化劑的研究上。

2.2.1 營養劑

由于精子只能進行分解代謝，需要在其稀釋液中添加一些六碳糖作為營養劑，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、海藻糖等，以補充精子能量耗損。可見在豬精液稀釋液中補充糖類非常重要，研究發現，以果糖效果最好。但在實際生產中，考慮到果糖價格較貴，多用蔗糖或葡萄糖作替代。研究表明，在豬凍精稀釋液中加入低濃度的六碳糖能取得較好的保存效果，過高濃度反而對精子頂體有害。Yi 等[1]研究發現，如果加入可溶解性氮-乙酰-D-氨基葡萄糖（0.05%）于豬凍精稀釋液中，解凍后的精子頂體完整率和活率有顯著提高。Paulenz 等[2]研究發現，稀釋液中添加果糖和蔗糖的效果反而不及乳糖好。李青旺等[3]研究表明，在豬凍精稀釋液中添加復合多糖（乳糖+2%～3%的葡萄糖）的效果較好。潘紅梅等[4]也研究了不同濃度的雙糖混合液對豬凍精保存效果的影響，發現乳糖（33.3%）+蔗糖（66.7%）組合對豬凍精保存的效果是最好的。

2.2.2 抗凍劑

精液在快速冷凍過程中，為避免或減輕冰晶造成的機械性物理性損傷，需要在稀釋液中添加甘油、二甲基亞砜（DMSO）及三羥甲基氨基甲烷（Tris）等抗凍物質。劉晉津等[5]研究發現，4% 甘油濃度冷凍后精子活率為0.483±0.698，達到最佳狀態。二甲基亞砜就是一種毒性極低的抗凍劑，可以克服甘油濃度較高時對精子的滲透毒性影響。馬麗等[6]研究表明，用二甲基亞砜完全替代甘油的凍精解凍后，添加6%二甲基亞砜試驗組的精液品質質量有明顯提升，分別達到：精子活率26%、精子畸形率16%、質膜完整率49%及頂體完整率51%，均明顯優于其他二甲基亞砜添加組（P<0.05）和對照組，也優于30 mL/L甘油組，且最佳添加劑量為60 mL/L；同時，750 mL/L甘油與250 mL/L二甲基亞砜混合凍精解凍后的活率優于只添加二甲基亞砜組的效果，且畸形率、頂體完整率、質膜完整率優于30 mL/L甘油對照組。除了單一研究某種抗凍物質對豬精液冷凍保存的作用效果外，2種及多種混合抗凍物質對精液冷凍保存效果的探索也一直沒有中斷過。研究發現，谷氨酰胺等氨基酸可發揮類似甘油保護劑的功能，但又不可能徹底取代甘油，需要通過與卵黃、甘油等結合使用才能產生保護作用[7]。張樹山等[8]研究發現，在雞卵黃低密度脂蛋白（9%）冷凍稀釋液中添加40 mmol/L的谷氨酰胺對冷凍豬精子直線向前運動速度、精子活率、頂體完整率和質膜的完整性均達到最佳，優于對照組（P<0.05）。

表1 公豬精液品質評價項目參考值

表2 豬精液凍精稀釋液主要成分

2.2.3 抗氧化劑

豬精液冷凍過程中會產生大量的活性氧（ROS），有賴于添加外源性的抗氧化劑進行消除，以維持精子細胞完整的結構不被破壞。有研究表明，在豬精液冷凍稀釋液中添加一定濃度的維生素C或維生素E能夠提高精子活率，保持解凍后精子頂體結構的完整性[9,10]。黃俻華等[11]研究發現，豬精液冷凍稀釋液中如果加入維生素C或維生素E的濃度較高時，精子頂體、質膜的完整性、線粒體的活性以及解凍后精子的存活時間將會得到顯著提高。事實表明，600 μg/mL 的維生素C或維生素E，是顯著提高陸川豬精液冷凍保存效果的最佳添加劑量，解凍后精子的活力和畸形率都顯著優于對照組（P<0.05）。Gadea等[12]研究發現，在豬精液冷凍稀釋液中添加適量還原GSH可以增強精子核蛋白結構的穩定性，保持其受精能力，解凍后精子質量獲得整體性的提高。張斌等[13]研究發現，豬精液冷凍稀釋液中添加5 mmol / L 的GSH和900 μg/ mL的HA能明顯增強豬精液冷凍效果。Varo-Ghiuru等[14]研究發現，豬凍精稀釋液中保持適當濃度的葉黃素有助于維持精子結構的完整，增強解凍后精子對滲透壓的耐受性，提高精子活率。王捷等[15]研究結果表明，天然抗氧化劑芝麻酚（3，4－亞甲二氧基苯酚，sesamol，SM）非常利于豬精子的冷凍保存，0.2 g/L芝麻酚為保持精子結構完整性的最佳添加劑量，其解凍后豬精子活率和抗氧化能力得到顯著提高（P<0.05）。孫艷青等[16]研究發現，新型高效抗氧化劑—葡萄籽原花青素（葡萄籽提取物）對冷凍—解凍后的豬精子抗氧化具有保護作用，其抗氧化能力大大超過維生素C和維生素E。結果顯示，40 μg/mL的葡萄籽原花青素是最佳添加劑量，精液冷凍保存效果均優于其他對照組。有的學者研究發現，紅景天多糖、淫羊藿多糖等均具有較強的免疫活性和抗氧化活性，紅景天多糖的最佳添加劑量為6 mg/mL，淫羊藿多糖的最佳添加量為4 mg/mL，可顯著提高解凍后精子的活率、質膜及頂體完整率[17，18]。

2.3 豬精液冷凍各環節溫度的調控

豬精子對溫度最為敏感，而豬精液冷凍過程中幾乎每一個環節都涉及到溫度（如表3），只有嚴格按照各環節所要求的溫度條件下實施操作，才不會使精子發生冷休克以及形態和結構上的改變，確保凍精質量的穩定可靠。

2.4 精液冷凍生產過程中的質量控制

豬精液冷凍技術受到豬品種、稀釋液的組成、滲透壓、糖、冷凍保護劑、添加物凍前處理、冷凍保存承載工具、冷凍解凍程序等眾多因素的影響。大量研究表明，豬精液冷凍解凍后效果不盡一致，也驗證了豬冷凍精液質量容易出現波動，質量不穩定。精液冷凍過程中任何一個關鍵技術環節上的不規范或操作失誤均可導致凍精質量下降或制作失敗。以冷凍保存承載工具及冷凍過程對精液冷凍保存效果的影響為例，薛琦[19]研究發現，即使都是細管凍精，但它們解凍后精子的活率存在差異，0.5 mL細管凍精好于0.25 mL細管凍精；距離液氮面的距離也會影響凍精解凍后精子的活率，距離液氮面較近的凍精，解凍后的活率優于距離液氮距離較遠的。因此，為確保豬精液凍后質量始終處于穩定與可控狀態，對生產工藝流程的每一個環節與每一個步驟，均應嚴格按照規范化、標準化作業程序執行，不定期對精液質量性狀進行評估和追溯分析，對存在的問題及時進行改進與優化，為豬冷凍精液技術規范標準提供經驗積累，也為今后實施養豬標準化生產奠定堅實基礎。

3 問題與展望

雖然豬精液冷凍技術的研究與應用取得了一定成效，但從全球范圍看，豬冷凍精液配種還不到0.5%，說明豬精液冷凍保存技術仍有很多問題需要解決。如缺乏冷凍保存各工藝流程制作標準和規范以及缺乏一套完整的、科學的冷凍與保存體系等。盡管如此，由于中國乃至全球養豬業所占的市場份額決定了人們會不斷探索和改進豬精液冷凍技術存在的諸多關鍵性技術難題，對豬冷凍精液技術的研究和推廣只會更加深入。百鈞達公司在豬精液冷凍技術方面已經取得突破，能夠使解凍的凍精達到76%～85%的活率，讓我們看到了勝利的曙光。可以預言，豬冷凍精液取代鮮精配種是大勢所趨，豬凍精的商業化應用指日可待。

表3 豬精液冷凍工藝流程溫度要求